Novel active and passive immunotherapy regimens against nosocomial infections caused by multidrug resistant enterococci

Abstract

Enterococci are natural inhabitants of the gastrointestinal tract and they are the second most common Gram-positive pathogens responsible for nosocomial infections. Passive and active immunotherapies targeting capsular polysaccharides and surface-associated proteins have emerged as a potential prevention and/or treatment strategy against this opportunistically pathogenic bacterium.In the first part of this study we evaluated the potential use of two protein immunogens from Enterococcus faecium, the secreted antigen A (SagA) and the peptidyl-prolyl cis-trans isomerase (Ppic), as carrier proteins conjugated with the capsular polysaccharide diheteroglycan (DHG) from E. faecalis. These two glycoconjugates (DHG-SagA and DHG-PpiC) could serve as cross-species vaccines against enterococcal infections. For this purpose, rabbits were immunized with the two glycoconjugates, and increasing IgG titers against the immunogens and their components were reported. In addition, the cross-reactivity of the sera was confirmed by evaluation of their in vitro opsonophagocytic killing activity and their immunoreactivity in whole cell ELISA against several E. faecalis and E. faecium strains. The sera, also, conferred protection in mice challenged with the respective enterococcal strains. These results support the potential use of these proteins as carrier proteins and the ability of these glycoconjugate vaccines to provide broader coverage against enterococcal infections. (Publication I)In the second part of this study we developed two mAbs against two well characterized immunogens, DHG and SagA, from E. faecalis and E. faecium, respectively. For the development of these mAbs mice were immunized with the glycoconjugate DHG-SagA, also used in the previous study, and the hybridoma technology was used. The implementation of the opsonophagocytic assay for the selection of the hybridomas was investigated. The two mAbs developed through this process were further characterized for their immunoreactivity by in vitro immunological assays. Both the generated mAbs, DHG.01 and SagA.01, exhibited high affinity and specificity to their targets. In addition, the in vitro opsonophagocytic killing activity of these mAbs against different enterococcal strains was proven, confirming their cross-specificity. These mAbs could serve as a potential immunotherapy against enterococcal infections especially upon humanization. For this purpose, the sequencing of the mAbs and the evaluation of the resulting sequences by the same immunological assays were performed. Finally, the development of these two mAbs upon immunization with DHG-SagA, combined with the previous project, confirm that SagA is a good carrier protein and that the DHG-SagA glycoconjugate is a potential vaccine candidate against prevalent enterococcal species. (Publication II)

Οι εντερόκοκκοι αποτελούν μέρος της εντερικής χλωρίδας και είναι τα δεύτερα Gram-θετικά παθογόνα υπεύθυνα για νοσοκομειακές λοιμώξεις. Οι παθητικές και ενεργητικές ανοσοθεραπείες που στοχεύουν στους καψικούς πολυσακχαρίτες και στις διαμεμβρανικές πρωτεΐνες έχουν αναδειχθεί ως πιθανή στρατηγική πρόληψης ή/και θεραπείας ενάντια σε αυτό το ευκαιριακά παθογόνο βακτήριο. Στο πρώτο μέρος αυτής της μελέτης αξιολογήσαμε τη χρήση δύο πρωτεϊνικών ανοσογόνων από το στέλεχος Enterococcus faecium, του εκκρινόμενου αντιγόνου Α (SagA) και της πεπτιδυλο-προλυλ cis-trans ισομεράσης (Ppic), ως πρωτεΐνες-φορείς συζευγμένες με τον καψικό πολυσακχαρίτη diheteroglycan (DHG) από το στέλεχος E. faecalis. Αυτά τα δύο γλυκοσυζευγμένα σκευάσματα (DHG-SagA και DHG-PpiC) θα μπορούσαν να χρησιμεύσουν ως εμβόλια ενάντια σε πολλά στελέχη που προκαλούν εντεροκοκκικές λοιμώξεις. Για το σκοπό αυτό, ανοσοποιήθηκαν κουνέλια με τα δύο γλυκοσυζευγμένα εμβόλια και αναφέρθηκαν αυξανόμενοι τίτλοι IgG έναντι των ανοσογόνων και των επιμέρους συστατικών τους. Επιπλέον, η ικανότητα των ορών έναντι διαφόρων στελεχών E. faecalis και E. faecium, επιβεβαιώθηκε με την αξιολόγηση της in vitro οψωνοφαγοκυτταρικής τους ικανότητας και της ανοσοαντιδραστικότητάς τους στην ELISA. Οι οροί παρείχαν επίσης προστασία σε ποντίκια που προσβλήθηκαν από τα αντίστοιχα στελέχη εντερόκοκκου. Τα αποτελέσματα αυτά υποστηρίζουν τη δυνητική χρήση αυτών των πρωτεϊνών ως πρωτεϊνών-φορέων και την ικανότητα αυτών των γλυκοσυζευγμένων εμβολίων να παρέχουν ευρύτερη κάλυψη κατά των εντεροκοκκικών λοιμώξεων. (Δημοσίευση I) Στο δεύτερο μέρος αυτής της μελέτης αναπτύξαμε δύο μονοκλωνικά αντισώματα (mAbs) έναντι των δύο καλά χαρακτηρισμένων ανοσογόνων, DHG και SagA, από τα στελέχη E. faecalis και E. faecium, αντίστοιχα. Για την ανάπτυξη αυτών των mAbs ανοσοποιήθηκαν ποντίκια με το γλυκοσυζευγμένο εμβολίο DHG-SagA, που χρησιμοποιήθηκε και στην προηγούμενη μελέτη, και χρησιμοποιήθηκε η τεχνολογία υβριδώματος. Διερευνήθηκε η εφαρμογή της οψωνοφαγοκυτταρικής δοκιμασίας για την επιλογή των υβριδωμάτων. Τα δύο mAbs που αναπτύχθηκαν μέσω αυτής της διαδικασίας χαρακτηρίστηκαν περαιτέρω ως προς την ανοσοαντιδραστικότητά τους με ανοσολογικές δοκιμασίες in vitro. Και τα δύο παραγόμενα mAbs, DHG.01 και SagA.01, παρουσίασαν υψηλή συγγένεια και εξειδίκευση στους στόχους τους. Επιπλέον, αποδείχθηκε η in vitro οψωνοφαγοκυτταρική δράση αυτών των mAbs έναντι διαφορετικών στελεχών εντερόκοκκου, επιβεβαιώνοντας τη διαστελεχική τους δράση. Αυτά τα mAbs θα μπορούσαν να χρησιμεύσουν ως πιθανή ανοσοθεραπεία κατά των εντεροκοκκικών λοιμώξεων, ιδίως μετά την διαδικασία ανθρωποίησής τους. Για το σκοπό αυτό, πραγματοποιήθηκε η αλληλούχηση των mAbs και η αξιολόγηση των ανθρωποποιημένων αντισωμάτων που προέκυψαν με τις ίδιες ανοσολογικές δοκιμασίες. Τέλος, η ανάπτυξη αυτών των δύο mAbs κατά την ανοσοποίηση με DHG-SagA, σε συνδυασμό με τη προηγούμενη μελέτη, επιβεβαιώνουν ότι η SagA είναι μια καλή πρωτεΐνη-φορέας και ότι το γλυκοσυζευγμένο εμβολίο DHG-SagA αποτελεί ένα υποψήφιο εμβόλιο κατά των λοιμώξεων από εντεροκοκκικά στελέχη. (Δημοσίευση II)