Χαρακτηρισμός και διερεύνηση της ανθεκτικότητας στη φωσφίνη πληθυσμών κολεοπτέρων αποθηκών με διαφορετική γεωγραφική προέλευση

Abstract

In the current thesis, phosphine resistance was evaluated in different stored product insect populations, of different geographical origins. In this context, this thesis consists of independent chapters in determining phosphine resistance, which include the assessment of the level of resistance using different protocols, the study of biological factors related to resistance (fitness cost), the study of alternative to phosphine active ingredients and non-chemical methods for cross-resistance, the use of phosphine in field applications on different populations and finally the investigation of resistance at the molecular level. The wider aim of this research is to contribute to the knowledge of the level of resistance in various parts of the world, to determine the effects of resistance on basic biological parameters of stored product insects, as well as to investigate genetic factors related to resistance. In this context, this research is expected to contribute to the improvement of management practices towards mitigation of phosphine resistance in stored product insects.[-In the first chapter, different stored product insect species were collected from different parts of the world. More than 400 different insect populations were collected, 77 of which are presented in this work. These populations belonged to the species: Tribolium castaneum, Tribolium confusum, Sitophilus οryzae, Sitophilus granarius, Sitophilus zeamais, Oryzaephilus surinamensis, Rhyzopertha dominica, Lasioderma serricorne and Cryptolestes ferrugineus. Resistance was tested using four different protocols. a) the Food and Agriculture Organization (FAO) protocol, which is based on screening by exposure of the tested insects to 30 ppm for 20 hours, b) the dose response protocol, which is based on the exposure of the tested insects to phosphine to 50, 100, 200, 500, 700 and 1000 ppm for 3 days, c) the Cooperation Centre for Scientific Research Relative to Tobacco (CORESTA) protocol, which is based on the exposure of the tested insects to phosphine to 200 ppm for 4 days and 700 ppm for 10 days for the resistant populations, and d) the Phosphine Tolerance Test (PTT), based on the exposure of insects at 3000 ppm for 5, 10, 15, 20, 25, 30, 45, 60, 90, 120, 150, 180, 210 and 270 minutes. The protocol of FAO, dose response and CORESTA was slightly modified to the assessment period (from 14 days to 7 days) and for the PTT the time of exposure was extended for the active individuals from 90 min to 270 min, while the delayed mortality was evaluated 7 days later. For all protocols, after the termination of the exposure interval, the insects were classified as active, under narcosis or immobilized. Then, the exposed insects were transferred to a clear petri dish for an additional period of 7 days, and then classification was made again. In order to characterize each population as resistant, moderately resistant and susceptible the following characterization was used after 7 days of the delayed effect: 0-10, 11-80 and >80 % active individuals indicated that the population can be characterized as susceptible, moderately resistant and resistant. According to the FAO protocol, only 4 populations of T. castaneum were found to be resistant, while the majority of the populations were susceptible to phosphine. All populations of T. confusum were susceptible, whereas for the 31 populations of S. oryzae, 2 were resistant. For S. granarius one population was moderately resistant and all populations of S. zeamais were susceptible. Moreover, from the 7 populations of O. surinamensis, one was resistant. For R. dominica, from the 3 populations tested, one was resistant. Finally, from the 2 populations of L. serricorne, we found one to be resistant to phosphine. Regarding the dose response protocol the populations that were characterized as susceptible were those that did not survive at 50 ppm, as moderately resistant those that survived at 200 ppm, and as resistant those that survived at 500 ppm, 7 days after the termination of the exposure. According to the dose response, some populations were recorded with active individuals at 200-500 ppm. Indicatively, for T. castaneum, S. oryzae and R. dominica active individuals were recorded in 4, 2, and 1 populations, respectively. In the CORESTA protocol no active individuals were recorded for any of the populations tested, with the exception of T. castaneum RB1, S. oryzae 3Tusc and C. ferrugineus B1. These three populations were subsequently tested for the high dose CORESTA protocol, and found to have no active individuals. Finally, for PTT, active individuals were recorded until 270 minutes for two populations of T. castaneum (3SP18.1, D1), one population of T. confusum (9Cecy), six populations of S. oryzae (Gerhin, IT2, IT1, 3Tusc, 2HornHun, G1), and two populations of O. surinamensis (Vis17.1, Def3.1). Most of the populations tested were immobilized after 90 minutes or earlier.In the second chapter, differences in mobility and behaviour were evaluated in populations (resistant and susceptible to phosphine) of two major stored product insect species, T. castaneum and R. dominica. In this regard, laboratory bioassays in petri dish arenas were designed to determine if phosphine resistance has an impact on the walking and mobility behavior of adult beetles of both species. Results indicated that there were significant differences between resistant and susceptible populations for both species. Regarding velocity, R. dominica susceptible individuals moved faster than resistant ones. Moreover, the resistant populations showed reduced activity for several parameters tested compared to the susceptible populations. In the third chapter, population growth was evaluated for T. castaneum and L. serricorne populations with different susceptibility to phosphine. Plastic cylindrical vials were used for each population, with two different commodities for each species. We have recorded population growth after 35, 50, 65, 80, 95 and 110 days in two different commodities for each species. Our results clearly indicate that there were significant differences between resistant and susceptible populations for both species on the adult emergence of pupae and the total progeny production. Maize was not preferred for T. castaneum, as progeny production in this commodity was extremely low. Lasioderma serricorne populations preferred wheat flour + cornmeal + brewer’s yeast compared to wheat flour alone. Based on the results of the present study, population growth parameters may provide critical information for the fitness advantages or disadvantages of each population, in relation with resistance to phosphine.In the fourth chapter, molecular assays were designed in order to identify the mutations that are related with phosphine resistance in the dld gene, at the rph2 locus. We used susceptible and resistant populations of T. castaneum, R. dominica and S. oryzae. The results indicated the presence of the P45S and P49S mutations, which were associated with phosphine resistance in T. castaneum and R. dominica, respectively.In the fifth chapter, phosphine-resistant and -susceptible populations of T. castaneum and S. oryzae, were tested for their susceptibility in “real world” commercial phosphine fumigations. The insects were placed in vials with different commodities per species, and their mortality was measured after the termination of each trial. Then, the vials were kept in incubator chambers at 25 ° C and 65 % relative humidity for 65 days to measure progeny production. In most cases complete (100 %) mortality was recorded for all populations, with the exception of the two resistant populations, S. oryzae 3T and T. castaneum BTS. There was no progeny production for any of the populations tested, with very few exceptions, where offspring emergence was negligible.In the sixth chapter, the insecticidal efficacy of diatomaceous earth (DE) and organophosphorous compound (OP) pirimiphos methyl was evaluated for the control of phosphine-susceptible and -resistant populations of T. castaneum and S. oryzae. Insecticides were applied on wheat or rice at two doses: DE was applied at 1000 and 2000 ppm and pirimiphos methyl at 1 and 5 ppm. Adult mortality was measured after 7, 14 and 21 days of exposure and progeny production capacity on the treated substrates was evaluated 65 days later. For T. castaneum we found that DE at 2000 ppm was able to provide 100 % control of two out of the three populations examined, while for the third population, which was the most resistant to phosphine, mortality reached only 84 %. Similarly, there were differences in mortality levels after exposure to DE-treated grains between the two S. oryzae populations tested. At 1 ppm, pirimiphos methyl was not effective for any of the T. castaneum populations tested, but complete mortality was recorded for all populations at 5 ppm. In general, both populations of S. oryzae were more susceptible than those of T. castaneum, for both commodities.In the seventh chapter, nitrogen treatment was evaluated on phosphine-resistant and -susceptible populations of O. surinamensis, T. castaneum and S. oryzae. Nine trials were conducted in commercial nitrogen chambers with the O2 level set at 1 %. Two different temperatures, i.e. 28 and 40 °C, and three exposure intervals, i.e. 2.5, 3 and 9 days were used in our tests. The insects were placed in vials with different commodities per species, and their mortality was measured after the termination of each trial. Then, the vials were kept in incubator chambers at 25 °C and 65 % relative humidity for 65 days to measure progeny production. Complete parental mortality was observed in all cases for all populations of O. surinamensis and S. oryzae, but there was some survival for both populations of T. castaneum at 28 °C and 3 days of exposure. In general, progeny production was completely (100 %) suppressed, with few exceptions for all species and populations. The results indicate that low oxygen is effective for all species tested, regardless of their resistance status to phosphine.In the eighth chapter, heat treatment was evaluated on phosphine-resistant and -susceptible populations of T. castaneum and S. oryzae. The insects were placed in vials with different commodities per species, and their mortality was measured after the termination of each trial. Then, the vials were kept in incubator chambers set at 25 °C and 65 % relative humidity for 65 days to measure progeny production. In most cases complete (100 %) mortality was recorded for all populations, regardless of their resistance to phosphine.

Στην παρούσα διδακτορική διατριβή προσδιορίστηκε και αξιολογήθηκε η ανθεκτικότητα πληθυσμών κολεοπτέρων αποθηκευμένων γεωργικών προϊόντων και τροφίμων με διαφορετική γεωγραφική προέλευση στο αέριο εντομοκτόνο φωσφίνη (ΡΗ3). Στο πλαίσιο αυτό, η διατριβή αυτή αποτελείται από αυτοτελείς δράσεις ως προς τον προσδιορισμό της ανθεκτικότητας στη φωσφίνη, οι οποίες περιλαμβάνουν την αξιολόγηση του επιπέδου ανθεκτικότητας με τη χρήση διαφορετικών πρωτοκόλλων, τη μελέτη των βιολογικών παραγόντων που σχετίζονται με την ανθεκτικότητα, την διερεύνηση της ανθεκτικότητας σε μοριακό επίπεδο, τη μελέτη άλλων εντομοκτόνων για την ύπαρξη διασταυρούμενης ανθεκτικότητας, τη χρήση της φωσφίνης σε εφαρμογές πεδίου και τέλος τις εναλλακτικές εφαρμογές για την αντιμετώπιση εντόμων αποθηκών. Σκοπός της έρευνας αυτής είναι η συμβολή στη γνώση του επιπέδου της ανθεκτικότητας σε διάφορες περιοχές του κόσμου (συμπεριλαμβανομένης και της χώρας μας), ο προσδιορισμός των επιπτώσεων της ανθεκτικότητας σε βασικές βιολογικές παραμέτρους των εντόμων, καθώς και η διερεύνηση γενετικών παραγόντων που σχετίζονται με την ανθεκτικότητα. Συνοψίζοντας, η έρευνα αυτή αποσκοπεί στην καλύτερη διαχείριση της ανθεκτικότητας με σκοπό τη διερεύνηση μεγάλου αριθμού παραγόντων που σχετίζονται με αυτή.Ειδικότερα στην πρώτη πειραματική ενότητα πραγματοποιήθηκε συλλογή εντόμων από διαφορετικές περιοχές στον κόσμο. Συλλέχθηκαν πάνω από 400 διαφορετικοί πληθυσμοί εντόμων αποθηκών. Στο πλαίσιο της διατριβής θα παρουσιαστούν 77 πληθυσμοί εντόμων αποθηκών λόγω του όγκου των δεδομένων, που ανήκουν στα εξής είδη: Tribolium castaneum, Tribolium confusum, Sitophilus οryzae, Sitophilus granarius, Sitophilus zeamais, Oryzaephilus surinamensis, Rhyzopertha dominica, Lasioderma serricorne και Cryptolestes ferrugineus. Οι πληθυσμοί αυτοί στη συνέχεια αξιολογήθηκαν για τον χαρακτηρισμό της ανθεκτικότητας τους στην φωσφίνη με την χρήση διαφόρων πρωτοκόλλων, τα οποία ήταν: 1. αυτό του FAO (Food and Agriculture Organization), το οποίο βασίστηκε στην έκθεση των εντόμων για 20 ώρες σε σταθερή συγκέντρωση των 30 ppm, 2. αυτό της δόσης απόκρισης (το λεγόμενο dose response) το οποίο βασίστηκε στην έκθεση των εντόμων σε 50, 100, 200, 500, 700 και 1000 ppm για 3 ημέρες έκθεσης, 3. αυτό του CORESTA (Cooperation Centre for Scientific Research Relative to Tobacco) που βασίστηκε στην έκθεση των εντόμων στα 200 ppm για 4 ημέρες και αν υπήρχαν ζωντανά άτομα, έκθεση αυτών των πληθυσμών σε 700 ppm για 10 ημέρες, και 4. αυτό του κιτ ανθεκτικότητας της PTT (Phosphine Tolerance Test) που βασίστηκε σε έκθεση των εντόμων στα 3000 ppm για 5, 10, 15, 20, 25, 30, 45, 60, 90, 120, 150, 180, 210 και 270 λεπτά. Το πρωτόκολλο του FAO, της δόσης απόκρισης και του CORESTA τροποποιήθηκαν ως προς τον χρόνο αξιολόγησης της καθυστερημένης θνησιμότητας (από 14 ημέρες σε 7 ημέρες), ενώ για το πρωτόκολλο PTT παρατάθηκε η καταγραφή των ζωντανών ακμαίων από τα 90 λεπτά στα 270 λεπτά και καταγράφηκε και η καθυστερημένη θνησιμότητα μετά από 7 ημέρες. Για όλα τα πρωτόκολλα που χρησιμοποιήθηκαν, μετά το πέρας της έκθεσης των εντόμων στη φωσφίνη τα έντομα κατηγοριοποιήθηκαν σε ζωντανά, ακινητοποιημένα και νεκρά. Στη συνέχεια, τα έντομα μεταφέρθηκαν σε καθαρά τρυβλία για την αξιολόγηση της καθυστερημένης συμπεριφοράς, 7 ημέρες αργότερα. Για τη διάγνωση κάθε πληθυσμού ως ανθεκτικού, μετρίως ανθεκτικού και ευαίσθητου χρησιμοποιήθηκε η εξής κατηγοριοποίηση για το FAO μετά τις 7 ημέρες καθυστερημένης επίδρασης: καταγραφή 0-10 % ζωντανών ακμαίων ο πληθυσμός χαρακτηρίζοταν ως ευαίσθητος, από 11-80 % ως μετρίως ανθεκτικός και πάνω από 80 % ως ανθεκτικός. Για το είδος T. castaneum σύμφωνα με το πρωτόκολλο του FAO, 4 πληθυσμοί χαρακτηρίστηκαν ως ανθεκτικοί και οι περισσότεροι πληθυσμοί χαρακτηρίστηκαν ως ευαίσθητοι στη φωσφίνη. Για το T. confusum και οι 8 πληθυσμοί χαρακτηρίστηκαν ευαίσθητοι στη φωσφίνη, ενώ για το S. oryzae από το σύνολο των 31 πληθυσμών 2 καταγράφηκαν ως ανθεκτικοί. Για το S. granarius ένας πληθυσμός χαρακτηρίστηκε ως μετρίως ανθεκτικός και οι υπόλοιποι ευαίσθητοι, όλοι οι πληθυσμοί του S. zeamais χαρακτηρίστηκαν ως ευαίσθητοι, ενώ για το O. surinamensis από τους 7 πληθυσμούς ο ένας χαρακτηρίστηκε ως ανθεκτικός. Τέλος, ένας πληθυσμός για τα R. dominica και L. serricorne, αντίστοιχα, χαρακτηρίστηκε ως ανθεκτικός. Όσον αφορά το πρωτόκολλο της δόσης απόκρισης οι πληθυσμοί που χαρακτηρίστηκαν ευαίσθητοι είναι αυτοί που δεν επιβίωσαν στη χαμηλότερη συγκέντρωση (50 ppm), οι μετρίως ανθεκτικοί θεωρήθηκαν αυτοί που επιβίωσαν μέχρι και τα 200 ppm και ανθεκτικοί αυτοί που επιβιώσαν από τα 500 ppm και πάνω, μετά από 7 ημέρες καθυστερημένης επίδρασης. Καταγράφηκαν πληθυσμοί που είχαν ζωντανά ακμαία στα 200-500 ppm. Ενδεικτικά, για τα T. castaneum, S. oryzae και R. dominica, καταγράφηκαν ζωντανά ακμαία σε 4, 2 και 1 πληθυσμούς, αντίστοιχα. Στο πρωτόκολλο CORESTA δεν παρατηρήθηκαν ζωντανά ακμαία σε κανέναν από τους πληθυσμούς που εξετάσθηκαν, με εξαίρεση τους πληθυσμούς T. castaneum RB1, S. oryzae 3Tusc και C. ferrugineus B1, οι οποίοι, εξετάσθηκαν στη συνέχεια και στο δεύτερο πρωτόκολλο CORESTA χωρίς να καταγραφούν όμως ζωντανά ακμαία. Όσον αφορά το κιτ ανθεκτικότητας PTT, καταγράφηκαν πληθυσμοί στους οποίους τα ακμαία ήταν δραστήρια μέχρι και τα 270 λεπτά έκθεσης. Αυτοί οι πληθυσμοί ήταν δύο για το T. castaneum (3SP18.1, D1), ένας για το T. confusum (9Cecy), έξι για το S. oryzae (Gerhin, IT2, IT1, 3Tusc, 2HornHun, G1) και δύο για το O. surinamensis (Vis17.1, Def3.1). Για τους περισσότερους πληθυσμούς, το σύνολο των ακμαίων βρέθηκαν να είναι ακινητοποιημένα στα 90 λεπτά, ή και σε ακόμα πιο σύντομα διαστήματα.Στην δεύτερη πειραματική ενότητα αξιολογήθηκαν διάφορες παράμετροι κινητικότητας των ακμαίων των T. castaneum και R. dominica σε πληθυσμούς με διαφορετικά επίπεδα ανθεκτικότητας. Για αυτό το λόγο, χρησιμοποιήθηκαν τρυβλία petri, για την μέτρηση διαφόρων παραμέτρων που αφορούν την κινητικότητα ακμαίων των ανωτέρω ειδών. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι υπήρχαν σημαντικές διαφορές μεταξύ των ανθεκτικών και των ευαίσθητων πληθυσμών. Όσον αφορά την ταχύτητα, μόνο για το R. dominica, τα ευαίσθητα άτομα κινούνταν ταχύτερα από τα ανθεκτικά. Επιπλέον, ο ανθεκτικός πληθυσμός παρουσίασε μειωμένη κινητικότητα για ορισμένες παραμέτρους που δοκιμάστηκαν σε σύγκριση με τον ευαίσθητο πληθυσμό.Στην τρίτη πειραματική ενότητα, έγινε σύγκριση της δυνατότητας παραγωγής απογόνων μεταξύ ανθεκτικών και ευαίσθητων πληθυσμών των T. castaneum και L. serricorne. Χρησιμοποιήθηκαν πλαστικά κυλινδρικά φιαλίδια, με την χρήση δύο διαφορετικών υποστρωμάτων για κάθε πληθυσμό και η καταγραφή των απογόνων έλαβε χώρα μετά από 35, 50, 65, 80, 95 και 110 ημέρες. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι ανθεκτικοί πληθυσμοί μπορεί να έχουν υψηλότερη παραγωγή απογόνων και ταχύτερη ανάπτυξη σε κάποιες περιπτώσεις σε σχέση με τους ευαίσθητους πληθυσμούς. Επιπλέον, η τροφή ήταν κρίσιμος παράγοντας για την παραγωγή απογόνων για όλους τους πληθυσμούς και τα είδη που δοκιμάστηκαν ανεξαρτήτως του επιπέδου ανθεκτικότητας. Ο ρυθμός ανάπτυξης μεταξύ των τροφών ήταν ανεξάρτητος από τον πληθυσμό, καθώς όλοι οι πληθυσμοί που δοκιμάστηκαν έδειξαν παρόμοιες προτιμήσεις ανεξάρτητα από το επίπεδο ανθεκτικότητας.Στην τέταρτη ενότητα εργασίας εξετάσθηκε η μοριακή ταυτοποίηση των μεταλλαγών που ευθύνονται για την υψηλή ανθεκτικότητα στην φωσφίνη, στο γονίδιο dld εντόμων αποθηκών στο rph2 τόπο. Συγκεκριμένα, έντομα ευαίσθητα και ανθεκτικά των ειδών T. castaneum, R. dominica και S. oryzae αξιολογήθηκαν για την καταγραφή των μεταλλαγών που σχετίζονται με την ανθεκτικότητα. Επισημάνθηκε η παρουσία των μεταλλαγών P45S και P49S που σχετίζονται με την ανθεκτικότητα στη φωσφίνη μόνο στα είδη T. castaneum και R. dominica, αντίστοιχα.Στην πέμπτη ενότητα εργασίας έγινε αξιολόγηση πληθυσμών ανθεκτικών και ευαίσθητων στη φωσφίνη σε πραγματικές συνθήκες εφαρμογής του αερίου για τα T. castaneum και S. oryzae. Τα έντομα τοποθετήθηκαν σε φιαλίδια με διαφορετικό προϊόν ανά είδος και η θνησιμότητά τους μετρήθηκε μετά τον τερματισμό της κάθε δοκιμής. Στη συνέχεια, τα φιαλίδια διατηρήθηκαν σε θαλάμους επώασης στους 25 °C και σε 65 % σχετική υγρασία για 65 ημέρες για τη μέτρηση της παραγωγής απογόνων. Στις περισσότερες περιπτώσεις καταγράφηκε 100 %θνησιμότητα για όλους τους πληθυσμούς με εξαίρεση τους ανθεκτικούς πληθυσμούς S. oryzae 3T και T. castaneum BTS. Δεν καταγράφηκε παραγωγή απογόνων στις περισσότερες περιπτώσεις, ενώ όπου υπήρχε παραγωγή απογόνων, κυμάνθηκε σε ιδιαίτερα χαμηλά επίπεδα.Στην έκτη πειραματική ενότητα, αξιολογήθηκε η γη διατόμων και το pirimiphos methyl σε ευαίσθητους και ανθεκτικούς πληθυσμούς των T. castaneum και S. oryzae στη φωσφίνη. Τα εντομοκτόνα εφαρμόστηκαν σε δύο δημητριακά, το σιτάρι και το ρύζι σε δύο διαφορετικές συγκεντρώσεις: για τη γη διατόμων εφαρμόστηκαν οι συγκεντρώσεις 1000 και 2000 ppm και για το pirimiphos methyl οι συγκεντρώσεις 1 και 5 ppm. Η θνησιμότητα των ακμαίων μετρήθηκε μετά από 7, 14 και 21 ημέρες έκθεσης και αξιολογήθηκε η ικανότητα παραγωγής απογόνων μετά από 65 ημέρες. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι πλήρης αντιμετώπιση των ακμαίων παρατηρήθηκε για δύο από τους τρεις πληθυσμούς του T. castaneum στα 2000 ppm της γης διατόμων, ενώ για τον τρίτο πληθυσμό, η θνησιμότητα έφτασε το 84 %. Σημαντικές διαφορές παρατηρήθηκαν στα επίπεδα θνησιμότητας μετά την έκθεση σε γη διατόμων μεταξύ των δύο πληθυσμών του S. oryzae. Επιπλέον, το pirimiphos methyl δεν ήταν αποτελεσματικό για κανέναν από τους πληθυσμούς του T. castaneum που αξιολογήθηκαν στο 1 ppm, αλλά 100 % θνησιμότητα καταγράφηκε για όλους τους πληθυσμούς στα 5 ppm. Γενικά, αμφότεροι οι πληθυσμοί του S. oryzae ήταν πιο ευαίσθητοι από εκείνους του T. castaneum και για τα δύο εντομοκτόνα.Στην έβδομη ενότητα εργασίας αξιολογήθηκε η χρήση αζώτου σε ευαίσθητους και ανθεκτικούς πληθυσμούς στην φωσφίνη των Ο. surinamensis, T. castaneum και S. oryzae σε πειράματα με δοκιμές σε εμπορικούς θαλάμους αζώτου. Εννέα δοκιμές έλαβαν χώρα σε εμπορικούς θαλάμους με δύο διαφορετικές θερμοκρασίες, 28 και 40 °C, με διαφορετικά διαστήματα έκθεσης, 2.5, 3 και 9 ημέρες και επίπεδο Ο2 στο 1 %. Τα έντομα τοποθετήθηκαν σε φιαλίδια με διαφορετικό προϊόν ανά είδος και η θνησιμότητά τους μετρήθηκε μετά τον τερματισμό κάθε δοκιμής. Μετά το τέλος κάθε δοκιμής, τα φιαλίδια διατηρήθηκαν σε θαλάμους επώασης στους 25 °C και 65 % σχετική υγρασία για 65 ημέρες για τη μέτρηση της παραγωγής απογόνων. Ολική θνησιμότητα παρατηρήθηκε για τα O. surinamensis και S. oryzae, αλλά υπήρξε κάποια επιβίωση (3.3 %) για το T. castaneum στους 28 °C και 3 ημέρες έκθεσης. Γενικά, δεν καταγράφηκε παραγωγή απογόνων, με μόνο ορισμένες εξαιρέσεις. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι το άζωτο είναι αποτελεσματικό για όλα τα είδη που δοκιμάστηκαν εδώ, ανεξάρτητα από το επίπεδο ανθεκτικότητάς τους στη φωσφίνη.Στην όγδοη ενότητα εργασίας μελετήθηκε η χρήση της θερμικής απεντόμωσης (heat treatment) σε πραγματικές συνθήκες με ανθεκτικούς και ευαίσθητους πληθυσμούς στην φωσφίνη των Τ. castaneum και S. oryzae. Η θνησιμότητα των εντόμων μετρήθηκε στο τέλος κάθε δοκιμής και στη συνέχεια, τα φιαλίδια με τα δημητριακά τους διατηρήθηκαν στους 25 οC με 65 % σχετική υγρασία για 65 ημέρες ώστε να μετρηθεί η παραγωγή απογόνων. Στην πλειοψηφία των δοκιμών που έγιναν παρατηρήθηκε πλήρης αντιμετώπιση τόσο των ανθεκτικών όσο και των ευαίσθητων στη φωσφίνη πληθυσμών.