Identifications of new micromolecular ligands for the membrane receptor of androgens, oxer1 and study of their mechanism of action

Abstract

The action of androgens is mediated mainly through intracellular androgen receptors, which belong to the nuclear family of receptors. These receptors are a set of transcription fac-tors that determine key cell processes. A recent study by our team identified an alternative an-drogen receptor on the membrane of prostate cancer cells, OXER1 (5-oxo-6E, 8Z, 11Z, 14Z-eicosatetraenoic acid receptor). It is a receptor belonging to the GPCRs family, which was iso-lated and characterized approximately 18 years ago. Prostate cancer is known to be one of the most serious hormone-dependent and hormone-sensitive tumors. Prostate cancer located in the male reproductive system and most types of this cancer develop slowly. Prostate cancer is also very metastatic and can spread to other parts of the body. Epidemiological data on prostate cancer show that it is the second most common cancer. Current treatments for this cancer are not fully effective. Natural products may have a pharmacological effect and a therapeutic bene-fit in the treatment of diseases such as prostate cancer. Compounds from nature can often be used as a starting point in the process of discovering new drugs. Many prostate cancer therapies aim to inhibit androgen receptor signaling because the role of these receptors in prostate cancer is extremely important. Also, the arachidonic acid signaling pathway plays a key role in carcin-ogenesis and for this reason many natural products have been tested as inhibitors in the signal-ing and metabolism pathways of arachidonic acid and its derivatives. Membrane androgen re-ceptors (mARs) are involved in the activation of various kinases and lead to processes that af-fect the growth and metastasis of cancer cells. Finding natural products as regulators of the ac-tion of membrane androgen receptors may be the key to inhibit carcinogenic processes. The research needs for a better understanding of the mechanism of action of androgens and finding new anti-cancer therapeutic targets and / or substances is extremely high. The aim of the disser-tation was to identify micromolecular compounds that will bind to the membrane receptor of androgens, OXER1 and will have a competitive effect such as testosterone, since this receptor induces the survival of cancer cells, and possibly explore them as anticancer agents. In particu-lar, OXER1 receptor is an oxo-lipid receptor that defines important functions in conditions such as inflammatory reactions and cancer. Our research team has shown that the OXER1 re-ceptor mediates the rapid effects of androgens, as testosterone binds to it and competes with the actions of its lipid ligand (5-oxo-ETE). The OXER1 receptor is involved in allergic responses that include eosinophils and basophils. In particular, it mediates the effects of 5-oxo-ETE on eosinophil chemotaxis, actin polymerization and L-selectin elimination. It is also involved in the proliferation and development of prostate, breast, kidney and ovarian cancers. OXER1 re-ceptor function has been linked to the inhibition of cyclic 3', 5'-adenosine monophosphoric acid (cAMP), because it binds to a Gαi protein, while at the same time leading to an increase in in-tracellular calcium. In addition, activation of the OXER1 receptor induces phosphorylation of various kinases such as PI3K, Akt and ERK1/2. To achieve this study, the following approach was followed, starting with the modeling of the interaction of OXER1 receptor with testos-terone and 5-oxo-ETE. Due to the large number of natural products studied, an algorithm was designed and developed, allowing the fast and accurate classification of the examined chemical molecules. Next, using the advanced bioinformatics tool, OXER1 competitors were identified. The tool was also used to study the interaction of other receptors / proteins. The selected mole-cules were analyzed by a wide range of bioinformatics tools. In vitro verification of the com-petitive properties of the selected compounds was performed in different cellular activities. The identified natural compounds, through bioinformatics methods, were tested in a number of cellular activities, related to the Gα and Gβγ activities of OXER1, such as cAMP, actin polymer-ization and their effect on calcium ion flow. In conclusion, the achievements of present thesis work are: First, a bioinformatic tool for the fast and accurate testing of different chemical compounds for their ability to act via OXER1. A tool that can be also used to study the interac-tion of other receptors / proteins (we present three different applications that verify its useful-ness). Second, nine compounds as antagonists of OXER1 with the best one verified in vitro, and finally more data on the signaling pathways triggered by testosterone via OXER1. All these support testosterone actions at the membrane level, via OXER1, and provide new tools and agents for possible novel therapeutic approaches in cancer.

H δράση των ανδρογόνων διαμεσολαβείται κυρίως μέσω ενδοκυτταρικών ανδρογονικών υποδοχέων, οι οποίοι υπάγονται στην υπεροικογένεια των πυρηνικών υποδοχέων. Οι υποδοχείς αυτοί αποτελούν ένα σύνολο μεταγραφικών παραγόντων που καθορίζουν βασικές διαδικασίες του κυττάρου. Πρόσφατη μελέτη της ομάδας μας, ταυτοποίησε έναν εναλλακτικό υποδοχέα αν-δρογόνων στη μεμβράνη των καρκινικών κυττάρων προστάτη, τον OXER1 (5-oxo-6E,8Z,11Z,14Z-eicosatetraenoic acid receptor). Πρόκειται, για ένα υποδοχέα που ανήκει στην οικογένεια των GPCRs, η απομόνωση και ο χαρακτηρισμός του οποίου έγινε περίπου πριν από 18 χρόνια. Είναι γνωστό ότι, ο καρκίνος του προστάτη αποτελεί μια από τις πιο σοβαρές ορμο-νοεξαρτώμενες και ορμονοευαίσθητες νεοπλασίες. Ο καρκίνος του προστάτη που βρίσκεται στο ανδρικό αναπαραγωγικό σύστημα και οι περισσότεροι τύποι αυτού του καρκίνου αναπτύσσο-νται αργά. Επίσης, οι καρκίνοι του προστάτη είναι πολύ μεταστατικοί και μπορούν να εξαπλω-θούν σε άλλες περιοχές του σώματος. Τα επιδημιολογικά δεδομένα του καρκίνου του προστάτη δείχνουν ότι είναι ο δεύτερος πιο κοινός καρκίνος. Οι τρέχουσες θεραπείες για αυτόν τον καρκίνο δεν είναι πλήρως αποτελεσματικές. Τα φυσικά προϊόντα έχουν αρκετές φορές φαρμακολογική δράση και μπορεί να έχουν θεραπευτικό όφελος στη θεραπεία ασθενειών, όπως ο καρκίνος του προστάτη. Οι ενώσεις που προέρχονται από τη φύση μπορούν συχνά να χρησιμοποιηθούν ως αφετηρία στη διαδικασία ανακάλυψης νέων φαρμάκων. Πολλές θεραπευτικές προσεγγίσεις κατά του καρκίνου του προστάτη στοχεύουν στην αναστολή της σηματοδότησης των ανδρογονικών υποδοχέων, επειδή ο ρόλος των υποδοχέων αυτών στον καρκίνο του προστάτη είναι εξαιρετικά σημαντικός. Επίσης, η σηματοδοτική οδός του αραχιδονικού οξέος παίζει βασικό ρόλο στην καρκινογένεση και για αυτό το λόγο πολλά φυσικά προϊόντα έχουν δοκιμαστεί ως αναστολείς στις οδούς σηματοδότησης και μεταβολισμού του αραχιδονικού οξέος και των παραγώγων του. Οι μεμβρανικοί υποδοχείς ανδρογόνων (mARs) εμπλέκονται στην ενεργοποίηση διαφόρων κινα-σών και οδηγούν σε διαδικασίες που επηρεάζουν την ανάπτυξη και μετάσταση καρκινικών κυτ-τάρων. Η εύρεση φυσικών προϊόντων ως ρυθμιστών της δράσης των υποδοχέων ανδρογόνων μεμβράνης μπορεί να είναι το κλειδί για την αναστολή καρκινογόνων διεργασιών. Η ερευνητική ανάγκη για καλύτερη κατανόηση του μηχανισμού δράσης των ανδρογόνων και ανεύρεση νέων αντικαρκινικών θεραπευτικών στόχων ή/και ουσιών είναι εξαιρετικά μεγάλη. Σκοπός της διδα-κτορικής διατριβής αποτελεί η εύρεση και η ταυτοποίηση μικρομοριακών ενώσεων που θα δε-σμεύονται στον μεμβρανικό υποδοχέα των ανδρογόνων OXER1 και θα έχουν ανταγωνιστική δράση όπως για παράδειγμα η τεστοστερόνη, διότι ο παραπάνω υποδοχέας επάγει την επιβίωση των καρκινικών κυττάρων, με τελικό στόχο την πιθανή χρήση τους ως αντικαρκινικά φάρμακα. Συγκεκριμένα, ο υποδοχέας OXER1 είναι ένας υποδοχέας οξο-λιπιδίου που ορίζει σημαντικές λειτουργίες σε καταστάσεις όπως οι φλεγμονώδεις αντιδράσεις και ο καρκίνος. Η ερευνητική μας ομάδα έχει αποδείξει ότι, ο υποδοχέας OXER1 διαμεσολαβεί ταχείες δράσεις των ανδρογό-νων, καθώς η τεστοστερόνη δεσμεύεται σε αυτόν και ανταγωνίζεται τις δράσεις του λιπιδικού προσδέτη του (5-oxo-ETE). Ο υποδοχέας OXER1 εμπλέκεται σε αλλεργικές αποκρίσεις που πε-ριλαμβάνουν ηωσινόφιλα και βασεόφιλα. Ειδικότερα, μεσολαβεί στις επιδράσεις του 5-οxο-ΕΤΕ στη χημειοταξία των ηωσινόφιλων, στον πολυμερισμό ακτίνης και στην αποβολή της L-σελεκτίνης. Εμπλέκεται επίσης στο πολλαπλασιασμό και την ανάπτυξη καρκίνου προστάτη, μα-στού, νεφρών και ωοθηκών. Η λειτουργία του υποδοχέα OXER1 έχει συνδεθεί με την αναστολή του κυκλικού 3’,5’-αδενοσινομονοφωσφορικού οξέος (cAMP), διότι συνδέεται με μία Gαi πρω-τεΐνη, ενώ ταυτόχρονα οδηγεί σε αύξηση της ροής του εξωκυττάριου ασβεστίου προς το εσωτε-ρικό των καρκινικών κυττάρων. Επιπρόσθετα, η ενεργοποίηση του υποδοχέα ΟΧΕR1 επάγει την φωσφορυλίωση διαφόρων κινασών όπως οι PI3K, Akt και ERK1/2. Για να επιτευχθεί η μελέτη αυτή ακολουθήθηκε η ακόλουθη προσέγγιση, ξεκινώντας από την μοντελοποίηση της αλληλεπί-δρασης του υποδοχέα OXER1 με την Τεστοστερόνη και τον 5-oxo-ETE. Λόγω του μεγάλου α-ριθμού των φυσικών προϊόντων που μελετήθηκαν, σχεδιάστηκε και αναπτύχθηκε ένας αλγόριθ-μος, επιτρέποντας την γρήγορη και ακριβή ταξινόμηση των εξεταζόμενων χημικών μορίων. Έ-πειτα, με την χρήση του ανεπτυγμένου εργαλείου βιοπληροφορικής πραγματοποιήθηκε η ανα-γνώριση των ανταγωνιστικών υποκαταστατών του OXER1. Παράλληλα το εργαλείο χρησιμο-ποιήθηκε για τη μελέτη της αλληλεπίδρασης και άλλων υποδοχέων/πρωτεϊνών. Τα επιλεγμένα μόρια αναλύθηκαν από μια μεγάλη σειρά βιοπληροφορικών εργαλείων. Στην συνέχεια πραγμα-τοποιήθηκε επαλήθευση in vitro των ανταγωνιστικών ιδιοτήτων των επιλεγμένων ενώσεων, σε διαφορετικές κυτταρικές δράσεις. Οι ταυτοποιημένες φυσικές ενώσεις, μέσω των βιοπληροφορι-κών μεθόδων δοκιμάστηκαν σε μια σειρά κυτταρικών δράσεων, που σχετίζονται με τις δράσεις Gα και Gβγ του OXER1, όπως το cAMP, ο πολυμερισμός της ακτίνης και η επίδρασή τους στην ροή των ιόντων ασβεστίου. Συμπερασματικά, τα επιτεύγματα της παρούσας διατριβής είναι: Πρώτον, ένα βιοπληροφορικό εργαλείο για τον γρήγορο και ακριβή έλεγχο διαφορετικών χημι-κών ενώσεων για την ικανότητά τους να δρουν μέσω του OXER1. Ένα εργαλείο που μπορεί επί-σης να χρησιμοποιηθεί για τη μελέτη της αλληλεπίδρασης άλλων υποδοχέων / πρωτεϊνών (πα-ρουσιάζουμε τρεις διαφορετικές εφαρμογές που επιβεβαιώνουν τη χρησιμότητά του). Δεύτερον, εννέα ενώσεις ως ανταγωνιστές του OXER1 με την καλύτερη που επιβεβαιώθηκε in vitro, και τέλος περισσότερα δεδομένα σχετικά με τις οδούς σηματοδότησης που ενεργοποιούνται από την τεστοστερόνη μέσω του OXER1. Όλα αυτά υποστηρίζουν δράσεις τεστοστερόνης σε επίπεδο μεμβράνης, μέσω του OXER1, και παρέχουν νέα εργαλεία και παράγοντες για πιθανές νέες θε-ραπευτικές προσεγγίσεις στον καρκίνο.