Η παρουσία στένωσης του εντέρου ως αναγκαίος συμπαράγοντας εκδήλωσης της νόσου Crohn σε έδαφος γενετικής προδιάθεσης: πειραματική μελέτη σε μύες TNFΔare στην ηλικία της εφηβείας

Abstract

Background: The pathophysiology of Crohn’s disease (CD) despite nearly a hundred years of modern research remains obscure. The widely accepted simplified concept of CD pathogenesis is that it results from abnormal responses of the intestinal immune system against the gut microflora in a genetically susceptible host. Clinical observations indicate that CD occurs or recurs proximal to narrow sites of the intestine, natural or iatrogenic. We advocate that site-specific factors, such as mechanical forces, contribute to the expression or recurrence of CD. To test that hypothesis, we investigated whether the creation of an intestinal stenosis could alter the severity of the expected Crohn-like ileitis, in a CD animal model, the TNFΔare/+ mouse. Materials and Methods: For the evaluation of our hypothesis a reliable long term intestinal partial obstruction mouse model was needed in combination with a genetic mouse strain with genetic predisposition for Crohn-like inflammation. Τhe mouse strain chosen for our study was TNFΔare/+ C57BL/6 due to the impressive resemblance of the Crohn-like disease presented on the animals, in pathologic, anatomic and molecular level, to the human CD. Due to the absence of a robust long-term intestinal incomplete obstruction mouse model, we conducted a preliminary experiment to evaluate the best model of partial intestinal obstruction between the most widely used techniques in the literature and a novel technique that our team developed.Sixty C57BL/6 mice aged 6 to 8 weeks were randomly divided into 5 major intervention groups: ligation, intestinal ring, partial ligation, microclips and the novel triple suture technique. The ring groups were subdivided into narrow, medium and wide ring and partial ligation groups were subdivided at 1/3, 1/2 and 2/3 of the lumen. The criteria of acceptance of a method were low mortality rates, long-term survival set at 4 weeks, macroscopic and microscopic evidence of obstruction, repeatability and reproducibility, low cost of materials and applicability to different animal sizes and species. Animals were euthanized after study period and studied macroscopically and the small bowel muscle layer thickness near the intervention was histopathologically evaluated. The “triple suture” group was the only group that met all criteria posed, with a survival rate of 90% at 4 weeks, the sutures were apparent in all cases, macroscopic evaluation showed small to mild proximal lumen dilatation in 6 out of 10 animals and histopathological evaluation of the specimens confirmed the partial obstruction. Thus, the triple suture technique was chosen for the protocol to test our core hypothesis. For the evaluation of our core hypothesis, thirty-six, 6-weeks-old TNFΔare/+ C57BL/6 mice, were divided into 3 intervention groups: triple suture, single suture and sham. 3 cm from the ileocecal valve on the ileum, in the first group, a triple suture stenosis was created, whereas, in the second, a loose suture was placed. The third group was sham operated. Same triple-suture stenosis was performed on twelve C57BL/6 wild type (WT) mice. All animals were sacrificed at 6 weeks post-operatively and were biometrically and macroscopically studied. Subsequently, the ileum parts near the intervention were excised and evaluated histopathologically. A summative total ileitis score (TIS) was applied in each sample using a bespoke semiquantitative histological scoring system for the Crohn-like changes, constructed especially for our protocol. Results: All mice gained weight and none developed signs of severe malaise or alterations in appetite and food consumption. The triple suture technique created an incomplete obstruction in all subjects as evaluated macroscopically and histopathologically by measuring muscle layer thickness of the specimens. The triple suture stenosis induced significant muscular hypertrophy proximal to interventional site which was more prominent in TNFΔare/+ than wild type mice. In triple suture group, the total ileitis score (TIS) was significantly increased proximal to the intervention as compared to the single suture (P: 0.004) and the sham groups (P: 0.013). The TIS distally, was unaffected, regardless of the experimental intervention. Intestinal stenosis did not induce intestinal inflammation (CD-like or other) in WT mice. Conclusions: Our research presents the first - to our knowledge - evidence that a surgically-induced long-term intestinal stenosis accelerates CD-like ileitis in inflammation-prone mice. Mechanical forces such as elevated intraluminal pressure prior to stenosis might be important co-factors to the pathophysiology of CD in genetically predisposed subjects.

Θεωρητικό υπόβαθρο: Η παθοφυσιολογία της Νόσου Crohn (CD) παρά τη σχεδόν εκατονταετή επιστημονική έρευνα, παραμένει εν πολλοίς άγνωστη. Η ευρύτερα αποδεκτή απλοποιημένη αντίληψη της αιτιοπαθογένειας της νόσου είναι ότι είναι αποτέλεσμα διαταραγμένης απάντησης του εντερικού ανοσολογικού συστήματος ενάντια στην μικροχλωρίδα του εντέρου σε γενετικά προδιατεθειμένα άτομα. Κλινικά, έχει παρατηρηθεί ότι η CD εμφανίζεται ή υποτροπιάζει πλησίον στενών ανατομικών σημείων του εντέρου, φυσικών ή ιατρογενών. Σε αυτή τη μελέτη υποθέτουμε ότι υπάρχουν ειδικοί παράγοντες που επάγουν αυτό το φαινόμενο όπως μηχανικοί παράγοντες πλησίον στενών σημείων που συμμετέχουν στην εμφάνιση ή την υποτροπή της CD. Για να ελέγξουμε αυτή την υπόθεση ελέγξαμε αν η δημιουργία μιας ιατρογενούς χειρουργικής στένωσης στο έντερο ενός ζωικού μοντέλου με γενετική προδιάθεση για ειλεΐτιδα τύπου CD, όπως ο TNFΔare/+ μυς, θα μπορούσε να επηρεάσει τη βαρύτητα της αναμενόμενης φλεγμονής κοντά στην θέση της παρέμβασης. Υλικά και μέθοδοι: Για τον έλεγχο της υπόθεσης ήταν απαραίτητη η διασφάλιση μιας τεχνικής μακροχρόνιας ατελούς απόφραξης σε μύες, σε συνδυασμό με ένα γενετικό είδος μυός το οποίο έχει γενετική προδιάθεση να εμφανίσει εντερική φλεγμονή τύπου CD.Το είδος μυός που επελέγη για την μελέτη ήταν το TNFΔare/+ C57BL/6 λόγω της μεγάλης ομοιότητάς της CD-like νόσου που εμφανίζουν τα ζώα σε ιστολογικό, μοριακό και ανατομικό επίπεδο με την ανθρώπινη CD. Λόγω της απουσίας στη βιβλιογραφία ενός αξιόπιστου μοντέλου μακρόχρονης εντερικής στένωσης σε μύες, ήταν απαραίτητη η πραγματοποίηση μιας προπαρασκευαστικής μελέτης που θα μας επέτρεπε να καταλήξουμε στο βέλτιστο μοντέλο, κατόπιν αξιολόγησης των συχνότερα χρησιμοποιούμενων μοντέλων ατελούς εντερικής απόφραξης της βιβλιογραφίας και ένα νέο μοντέλο που ανέπτυξε η ερευνητική μας ομάδα. Εξήντα C57BL/6 μύες, ηλικίας 6 - 8 εβδομάδων, χωρίστηκαν τυχαία σε 5 βασικές ερευνητικές ομάδες με βάση της τεχνική στένωσης που θα υποβάλλονταν. Η τεχνικές/ομάδες ήταν: περιβρογχισμός, δακτυλίδι εντέρου, μερική απολίνωση, μικροκλίπς (microclips) και η νέα μέθοδος του τριπλού ράμματος. Η ομάδα του δαχτυλιδιού υποδιαιρέθηκε στις ομάδες στενό, μεσαίο, ευρύ και η ομάδα μερικής απολίνωσης σε απολίνωση του 1/3, 1/2 και 2/3 του αυλού. Τα κριτήρια για την τελική επιλογή της βέλτιστης μεθόδου ήταν τα χαμηλά ποσοστά θνητότητας, η μακροπρόθεσμη επιβίωση των υποκειμένων – τουλάχιστον 4 εβδομάδες, η μακροσκοπική και μικροσκοπική επιβεβαίωση της παρουσίας απόφραξης στο πέρας της περιόδου μελέτης, η επαναληψιμότητα και η αναπαραγωγιμότητα τη μεθόδου, το χαμηλό κόστος των απαραίτητων υλικών και η δυνατότητα εφαρμογής της σε διαφορετικά είδη και σε ζώα διαφορετικού μεγέθους. Οι μύες της μελέτης ευθανατώθηκαν μετά την περίοδο μελέτης και μελετήθηκαν μακροσκοπικά ενώ το πάχος του μυϊκού χιτώνα του εντέρου πλησίον της παρέμβασης εκτιμήθηκε ιστοπαθολογικά. H oμάδα του τριπλού ράμματος ήταν η μόνη ομάδα που εκπλήρωσε τα κριτήρια που τέθηκαν, με επιβίωση 90% στις 4 εβδομάδες, τα ράμματα της παρέμβασης ήταν εμφανή σε όλες τις περιπτώσεις, η μακροσκοπική εκτίμηση ανέδειξε μικρή με μέτρια προστενωτική διάταση σε 6 από τα 10 ζώα και η παθολογοανατομική εκτίμηση των παρασκευασμάτων επιβεβαίωσε την επίτευξη μερικής απόφραξης. Έτσι, η τεχνική του τριπλού ράμματος επελέγη για την μελέτη της βασικής ερευνητικής μας υπόθεσης. Για τη μελέτη της βασικής μας υπόθεσης 36, TNFΔare/+ C57BL/6 μύες, 6 εβδομάδων, χωρίστηκαν σε 3 ομάδες παρέμβασης: τριπλού ράμματος, μονού ράμματος και sham. Στα 3 εκ από την ειλεοτυφλική βαλβίδα στον ειλεό, η πρώτη ομάδα υποβλήθηκε σε μια στένωση με την τεχνική του τριπλού ράμματος, η δεύτερη σε τοποθέτηση ενός μονού χαλαρού ράμματος και η τρίτη ομάδα σε επέμβαση sham. H ίδια στένωση με την τεχνική τριπλού ράμματος πραγματοποιήθηκε σε 12 μύες C57BL/6 WT. Όλα τα ζώα ευθανατώθηκαν στις 6 εβδομάδες μετεγχειρητικά και εκτιμήθηκαν βιομετρικά και μακροσκοπικά. Τα τμήματα του ειλεού πλησίον της παρέμβασης αφαιρέθηκαν και εκτιμήθηκαν ιστολογικά. Σε κάθε δείγμα δόθηκε μια ολική βαθμολογία ειλεΐτιδας (total ileitis score - ΤIS) με βάση μια νέα ημιποσοτική παθολογοανατομική κλίμακα που αναπτύχθηκε για την μελέτη μας, για να εκτιμήσει τις ιστολογικές αλλαγές τύπου CD. Αποτελέσματα Όλα τα ζώα πήραν βάρος χωρίς να εμφανίσουν σημεία βαριάς κακουχίας ή διαταραχές στην όρεξη. Η τεχνική του τριπλού ράμματος προκάλεσε επιτυχώς ατελή εντερική απόφραξη σε όλα τα ζώα με βάση την μακροσκοπική εκτίμηση αλλά και την παθολογοανατομική μέτρηση του μυϊκού χιτώνα των παρασκευασμάτων. Το τριπλό ράμμα προκάλεσε σημαντική υπερτροφία του μυϊκού χιτώνα στο προστενωτικό τμήμα του εντέρου, που ήταν πιο έντονη στα TNFΔare/+ ζώα από ότι στα WT. Στην ομάδα του τριπλού ράμματος η ολική βαθμολογία της ειλεΐτιδας (TIS) ήταν στατιστικά σημαντικά αυξημένη προστενωτικά σε σύγκριση με την ομάδα του μονού ράμματος (P: 0.004) και της ομάδα sham (P: 0.013). H ΤΙS μεταστενωτικά ήταν αμετάβλητη ανεξαρτήτως χειρουργικής παρέμβασης. Η εντερική στένωση δεν προκάλεσε εντερική φλεγμονή τύπου CD ή άλλου τύπου στα ποντίκια WT. Συμπεράσματα: H μελέτη μας παρουσιάζει για πρώτη φορά -στο βαθμό που γνωρίζουμε- ενδείξεις ότι η μακροχρόνια εντερική στένωση επιδεινώνει την τύπου CD ειλεΐτιδα σε μύες με γενετική προδιάθεση. Έτσι, θεωρούμε ότι πιθανώς μηχανικοί παράγοντες, όπως η αυξημένη ενδοαυλική πίεση εγγύτερα στενών περιοχών, μπορεί να είναι σημαντικοί ή και αναγκαίοι συμπαράγοντες στην παθοφυσιολογία της CD σε γενετικά προδιατεθειμένα άτομα.