Acoustic and optical characterization of soft biological matter and biopolymers

Abstract

In this thesis the Quartz Crystal Microbalance with Dissipation monitoring (QCM-D) is used in combination with other biophysical techniques in order to monitor the adsorption of various biological entities at the solid/liquid interface. The samples of interest are soft biological matter (cells) and biopolymers (polymers and proteins); effort is placed on the study and characterization of the interactions between the sample and the underlying substrate. The QCM-D was used in order to discriminate between two thyroid cell phenotypes, a normal and tumor one. Three surfaces were exploited as a substrate for adhesion studies: bare titanium, bare gold and fibrinogen-coated gold. Their adhesion to the three surfaces was monitored in real-time by QCM-D and the acoustic signals obtained were the frequency change, energy dissipation change, acoustic ratio ΔD/ΔF and rate of cell binding on the surface. In parallel, scanning electron microscopy (SEM) images were used to observe the morphology of the adhered cells on the three surfaces. The combination of both techniques provided valuable insight regarding cell adhesion. Our results suggest that the application of two surfaces for cell adhesion experiments can discriminate with accuracy between the two particular cell types and potentially form a platform for discrimination between normal and cancer thyroid cell types. The QCM-D combined with a spectroscopic ellipsometer was employed for in-situ monitoring of the adsorption of the copolymer PLL-g-PEG on gold surface and the subsequent binding of DNA molecules. Acoustic and optical data modeling gave an insight into the architecture of the copolymer and the bound DNA molecules; the “combined” thickness, “wet” and “dry” mass and the hydration of the formed film. By combining this new information with the acoustic ratio values obtained for the films we concluded that DNA is lying rather flat on the PLL-g-PEG copolymer. Overall, the property of the PLL-g-PEG copolymer to attract DNA molecules (due to the positively charged poly-lysine backbone) and at the same time to repel proteins through the grafted PEG units was confirmed. We highlight that the exceptional PLL-g-PEG copolymer architecture enabled the specific binding of DNA from whole Salmonela Thyphimurium cells in complex samples such as milk. The combined QCM-D/Ellipsometry technique was used to monitor in real-time the adsorption of avidin, streptavidin and neutravidin on gold surface. Acoustic and optical data modeling provided information about film properties such as refractive index, “dry” mass, “wet” mass and water content. Also, FTIR-ATR spectroscopy measurements were used to elucidate the protein secondary structure in the bulk and upon adsorption to gold surface; Raman spectroscopy measurements were only used for validation of the bulk secondary structure percentages obtained by FTIR-ATR. The acoustic data suggest that the adsorption of neutravidin on gold surface is quite different than avidin and streptavidin. Neutravidin always exhibited higher dissipation and acoustic ratio values than avidin and streptavidin. The low acoustic ratio values of avidin and streptavidin imply a tight interaction with gold surface which probably leads to higher decrease of β-sheet content than in the case of neutravidin. Acoustic and optical data modeling suggest that neutravidin films contain more water than avidin and streptavidin films. Moreover, the neutravidin films possibly contain more types and/or amount of water molecules than avidin and streptavidin films as deduced by the acoustic and spectroscopic data.

Στην παρούσα διδακτορική διατριβή ο ακουστικός βιοαισθητήρας QCM-D χρησιμοποιήθηκε σε συνδυασμό με διάφορες βιοφυσικές τεχνικές με σκοπό την παρακολούθηση της προσρόφησης διαφόρων βιολογικών «οντοτήτων» στην διεπιφάνεια στερού/υγρού. Οι «οντότητες» που θα μας απασχολήσουν σε αυτή τη διατριβή είναι: μαλακή βιολογική ύλη (κύτταρα) και βιοπολυμερή (πολυμερή και πρωτεΐνες). Ιδιαίτερη προσπάθεια καταβάλλεται για την μελέτη και τον χαρακτηρισμό των αλληλεπιδράσεων μεταξύ δείγματος και υποστρώματος. Ο ακουστικός βιοαισθητήρας QCM-D χρησιμοποιήθηκε για την διάκριση μεταξύ δυο κυτταρικών σειρών: υγιή και καρκινικά ανθρώπινα κύτταρα θυροειδή αδένα. Τρεις επιφάνειες χρησιμοποιήθηκαν ως υποστρώματα για τις μελέτες κυτταρικής προσκόλλησης: τιτάνιο, χρυσός και χρυσός με επικαλύψη από ινωδογόνο (fibrinogen). Η κυτταρική προσκόλληση στις τρεις επιφάνειες καταγράφηκε σε πραγματικό χρόνο από τον QCM-D και τα ακουστικά σήματα που αποκτήθηκαν είναι: η συχνότητα, η ενεργειακή απώλεια, ο ακουστικός λόγος (ενεργειακή απώλεια ανά μονάδα μάζας που προσδένεται στην επιφάνεια) και ο ρυθμός κυτταρικής πρόσδεσης. Παράλληλα, εικόνες ηλεκτρονικής μικροσκοπίας σάρωσης χρησιμοποιήθηκαν για την παρατήρηση της μορφολογίας των κυττάρων που προσκολλήθηκαν στις τρεις επιφάνειες. Ο συνδυασμός των δυο αυτών τεχνικών προσφέρει πολύτιμες πληροφορίες σχετικά με την διαδικασία της κυτταρικής προσκόλλησης. Τα αποτελέσματα μας δείχνουν ότι η χρήση δυο επιφανειών για τα πειράματα κυτταρικής προσκόλλησης μπορεί να διακρίνει με ακρίβεια μεταξύ των δυο κυτταρικών τύπων και πιθανώς να μπορεί να αποτελέσει μια πλατφόρμα για την διάκριση μεταξύ υγιών και καρκινικών κυτταρικών τύπων θυροειδή αδένα. Ο QCM-D σε συνδυασμό με ένα φασματοσκοπικό ελλειψόμετρο χρησιμοποιήθηκε για την παρακολούθηση της προσρόφησης του πολυμερούς PLL-g-PEG σε επιφάνεια χρυσού σε πραγματικό χρόνο και την μετέπειτα πρόσδεση μορίων DNA. Η μοντελοποίηση των ακουστικών και οπτικών πειραματικών δεδομένων προσέφερε πληροφορίες σχετικά με την αρχιτεκτονική του πολυμερούς και των προσδεδεμένων μορίων DNA και πιο συγκεκριμένα σχετικά με το πάχος, την «υγρή» (μόρια + νερό) και «στεγνή» (μόρια) μάζα και τα ποσοστά νερού των σχηματισμένων φιλμ. Χρησιμοποιώντας αυτήν την νέα πληροφορία σε συνδυασμό με τις τιμές ακουστικού λόγου που αποκτήθηκαν για αυτά τα φιλμ, καταλήξαμε στο συμπέρασμα ότι τα μόρια DNA προσδένονται με έναν επίπεδο τρόπο πάνω στο πολυμερές. Επιπλέον, επιβεβαιώσαμε την ιδιότητα του PLL-g-PEG πολυμερούς να έλκει μόρια DNA μέσω του θετικά φορτισμένου σκελετού από PLL και ταυτοχρόνως να απωθεί πρωτεΐνες μέσω των μονάδων PEG. Τέλος, επισημαίνουμε ότι η εξαιρετική αρχιτεκτονική του PLL-g-PEG πολυμερούς κατέστησε ικανή την πρόσδεση μορίων DNA από ολόκληρα κύτταρα Salmonela Thyphimurium μέσα σε πολύπλοκα δείγματα όπως γάλα. Επίσης, ο QCM-D σε συνδυασμό με την φασματοσκοπική ελλειψομετρία χρησιμοποιήθηκε για την παρακολούθηση της προσρόφησης της αβιδίνης, στρεπταβιδίνης και νιουτραβιδίνης σε επιφάνεια χρυσού σε πραγματικό χρόνο. Η μοντελοποίηση των ακουστικών και οπτικών πειραματικών δεδομένων προσέφερε πληροφορίες σχετικά με ιδιότητες των φιλμ όπως τον δείκτη διάθλασης, την «υγρή» (μόρια + νερό) και «στεγνή» (μόρια) μάζα και τα ποσοστά νερού. Επιπλέον, οι μετρήσεις με υπέρυθρη φασματοσκοπία (FTIR-ATR) χρησιμοποιήθηκαν για την εξιχνίαση της δευτεροταγούς δομής των πρωτεϊνών στο διάλυμα και μετά την προσρόφησή τους στην επιφάνεια χρυσού. Οι μετρήσεις με φασματοσκοπία Raman χρησιμοποιήθηκαν μόνο για την επιβεβαίωση των ποσοστών δευτεροταγούς δομής στο διάλυμα που αποκτήθηκαν με την χρήση FTIR-ATR. Τα ακουστικά πειραματικά δεδομένα προτείνουν ότι η προσρόφηση της νιουτραβιδίνης στο χρυσό είναι πολύ διαφορετική απ’ αυτή της αβιδίνης και στρεπταβιδίνης. Η νιουτραβιδίνη πάντα έδινε μεγαλύτερες τιμές σε ενεργειακή απώλεια και ακουστικό λόγο συγκριτικά με την αβιδίνη και στρεπταβιδίνη. Οι χαμηλές τιμές ακουστικού λόγου της αβιδίνης και στρεπταβιδίνης υποδηλώνουν την σφιχτή αλληλεπίδραση των πρωτεϊνών αυτών με τον χρυσό που πιθανώς οδηγεί σε υψηλότερη απώλεια β-φύλλων συγκριτικά με την νιουτραβιδίνη. Η μοντελοποίηση των ακουστικών και οπτικών πειραματικών δεδομένων προτείνει ότι τα φιλμ νιουτραβιδίνης περιέχουν περισσότερο νερό απ’ αυτά της αβιδίνης και στρεπταβιδίνης. Επιπλέον, τα φιλμ νιουτραβιδίνης περιέχουν περισσότερους τύπους ή/και ποσότητα μορίων νερού συγκριτικά με τα φιλμ αβιδίνης και στρεπταβιδίνης, όπως προκύπτει από τα ακουστικά και φασματοσκοπικά πειραματικά δεδομένα.