Μελέτη της επίδρασης των μεταβολών της αιμάτωσης των όρχεων στη γονιμοποιητική ικανότητα του κριού

Abstract

Fertility is a factor which ensures the income and the financial status of the farms. Periodically evaluation of rams’ reproductive ability is necessary, based on the selection of males after clinical and laboratory evaluation. Ultrasonographic examination of rams’ genital system can be performed in addition to clinical examination, enhancing its reliability. Furthermore, assessment of ram semen quality provides complete laboratory evaluation of spermatozoa’s fertilizing ability, which in combination with the clinical and ultrasonographic examination, provides high prognostic accuracy of male fertility. The objectives of the present thesis were to investigate the effect of the factors that affect ram semen fertilizing ability (age, season, breeding or non-breeding period) during a whole year, by evaluating semen quality characteristics. Moreover, semen quality of very old Chios rams (9-13 years old) was assessed and the benefit of their prolonged preservation at flocks was evaluated. In addition, testicular hemodynamic and echogenicity changes were recorded during a whole year, and the influence of factors affecting testicular vasculature and echotexture (age, season, ejaculation, breeding or non-breeding period) was investigated. Moreover, ram semen quality characteristics were correlated with testicular hemodynamic and echogenicity indices of males of different age, during breeding and non-breeding period. The study was conducted at the Unit of Biotechnology of Reproduction, Farm Animals Clinic, Faculty of Veterinary Medicine, Aristotle University of Thessaloniki and at the Department of Reproduction and Artificial Insemination, Directorate of Veterinary Centre of Thessaloniki. The survey was performed on 7 Chios breed rams divided in two age groups: three rams of 2-6 years old (mature) and four rams of 9-13 years old (old). Semen was collected from each ram biweekly during a year (breeding and non-breeding period). Semen volume and concentration were measured, and sperm motility was assessed subjectively at the laboratory of the Department of Reproduction and Artificial Insemination. Afterwards, semen samples were diluted by Ovixcell® extender (37o C) in final concentration 250x106 spermatozoa/ml and were transported to the Unit of Biotechnology of Reproduction, where the appropriate methods were applied in order to evaluate the following parameters: (i) motility and kinetics (CASA), (ii) viability-membrane integrity (eosin-nigrosin stain), (iii) morphology (SpermBlue stain), (iv) sperm membrane biochemical functionality (Hypo-osmotic swelling test-HOST) and (v) chromatin (DNA) integrity (acridine orange test). The ultrasound Esaote MyLab™One equipped with a linear probe 7.5 MHz for Pulsed wave spectral Doppler, as well as B-mode trans-scrotal scanning, was used. Testicular ultrasonographic examination was performed 24 hours prior to and immediately after ejaculation, for each testis separately. Pulsed wave spectral Doppler was performed on testicular artery to measure (i) Pulsatility index (PI), (ii) Resistive index (RI), (iii) End-diastolic velocity (EDV), (iv) Diameter (D), (v) Time-averaged maximum velocity (TAVM) and (vi) Blood flow volume (BFV). Images by B-mode ultrasound scanning of ram testes parenchyma were analyzed to evaluate: (i) Entropy (E), (ii) Contrast (Con), (iii) Correlation (Cor), (iv) Gradient variance (GV), (v) Standard deviation (StD), (vi) Long run emphasis (LRunEm), (vii) Mean value (MV), (viii) Gray value distribution (GVD), (ix) Runlength distribution (RunLD) and (x) Gradient mean value (GMV). Concerning the results of the effect of season on ram semen quality characteristics, the percentage of hyperactivated spermatozoa was significantly higher in non-breeding, compared to breeding period (p=0.011). The percentage of head abnormalities was higher in non-breeding period (p=0.001), whereas the percentage of tail abnormalities was significantly higher in breeding compared to non-breeding period (p=0.022). Sperm membrane biochemical functionality exhibited seasonal activity since HOST+ spermatozoa were significantly fewer in non-breeding, compared to breeding period (p<0.001). Moreover, higher volume and concentration were noticed in old compared to mature rams (p=0.001 and p<0.001, respectively). Ejaculation did not significantly affect hemodynamic and echogenicity values (p>0.05). The investigation of the effect of season on testicular vascularity revealed higher PI and RI of both testes, before and after ejaculation, in breeding compared to non-breeding season (p<0.001). Moreover, testicular artery D and BFV of left testis were higher during non-breeding compared to breeding season, before ejaculation (p=0.012 and p<0.001, respectively). Concerning the effect of ram age on vascularity, testicular artery D of right testis was wider in old rams, both before and after ejaculation (p=0,038 και p<0,001, respectively), whereas as for left testis, it was wider only after ejaculation (p=0,005). Moreover, left testis BFV was higher after ejaculation in old rams, compared to mature (p<0,001). Regarding the effect of season and ram age on testicular echotexture, the value of left testis GV before ejaculation was lower in breeding compared to non-breeding period (p=0.01). Left testis Cor before ejaculation was higher in breeding compared to non-breeding period (p=0.03). As for old compared to mature rams, right testis Con and Cor values were higher before ejaculation, whereas right testis Ent value was lower after ejaculation (p=0.03, p=0.05 and p=0.05, respectively). Correlation between hemodynamic and semen parameters revealed that left testis PI of mature rams was negatively correlated to semen concentration, after ejaculation, during breeding period (r=-0.5, n=33, p=0.003). Furthermore, both left and right testes RI were negatively correlated before ejaculation to total (r=-0.5, n=33, p=0.008/r=-0.4, n=33, p=0.01, respectively) and tail morphological abnormalities (r=-0.5, n=33, p=0.004/p=0.008, respectively). Moreover, left testis PI and right testis RI during non-breeding period in mature rams before ejaculation were positively correlated to semen volume (r=0.4, n=45, p=0.013 and r=0.6, n=45, p<0.001, respectively). Correlation between echotexture and semen parameters indicated that LRunEm, GVD and RunLD of old rams’ right testis during breeding period after ejaculation were highly negatively correlated to spermatozoa’s DNA fragmentation (r=-0.9, n=44, p<0.001), whereas for mature rams, only LRunEm of right testis was negatively correlated to this semen parameter before ejaculation (r=-0.6, n=33, p=0.001). Moreover, during non-breeding period, as for the same ram group, left testis LRunEm before ejaculation was negatively correlated to sperm tail and total morphological abnormalities (r=-0.8/r=-0.7, n=45, p<0.001). Old rams’ left testis Con, during non-breeding period, was correlated to immotile spermatozoa and viability (r=-0.6/r=0.6, n=60, p<0.001).In conclusion (i) some ram semen quality characteristics are affected by season (WOB, hyperactivation, sperm head and tail abnormalities, HOST+ spermatozoa), (ii) old rams preserve high semen quality, so they can be used in flocks up to the age of 13 years old, (iii) ejaculation does not significantly affect testicular hemodynamic and echogenicity indices, (iv) the main hemodynamic indices are testicular blood flow is affected by season but not by ram age, (v) season and ram age induce significant changes in values of certain testicular echotexture parameters (GV, Cor, Con, Ent), (vi) alterations in both ram testes blood flow and echotexture seem to be moderately correlated with the assessed sperm parameters, depending on season, ram age and ejaculation and (vii) B-mode and Doppler ultrasonography, in combination with semen analysis, contribute to the selection of fertile rams.

Η συστηματική κλινική και εργαστηριακή αξιολόγηση της γονιμότητας των κριών αποτελεί παράγοντα διασφάλισης της οικονομικότητας των εκμεταλλεύσεων. Η υπερηχοτομογραφική εξέταση του γεννητικού συστήματος των αρσενικών μπορεί να χρησιμοποιηθεί συμπληρωματικά της κλινικής εξέτασης, παρέχοντας μεγαλύτερο εύρος πληροφοριών και ενισχύοντας την αξιοπιστία της. Επιπλέον, η εκτίμηση της ποιότητας του σπέρματος των κριών, εξασφαλίζει τον ολοκληρωμένο εργαστηριακό έλεγχο της γονιμοποιητικής ικανότητας των σπερματοζωαρίων, που σε συνδυασμό με την κλινική και την υπερηχοτομογραφική εξέταση, ενδυναμώνει την πρόγνωση της γονιμότητας των αρσενικών. Στόχοι της παρούσας διατριβής ήταν η μελέτη της επίδρασης των παραγόντων που επηρεάζουν τη γονιμοποιητική ικανότητα του σπέρματος του κριού (ηλικία, εποχή, ένοιστρη ή άνοιστρη περίοδος) σε ετήσια βάση, μέσα από την αξιολόγηση των ποιοτικών χαρακτηριστικών του σπέρματος. Παράλληλα, εκτιμήθηκε η ποιότητα του σπέρματος υπερήλικων κριών φυλής Χίου (9-13 ετών) και έμμεσα αξιολογήθηκε η ωφελιμότητα ή μη της διατήρησής τους στα ποίμνια. Επιπλέον, καταγράφηκαν οι μεταβολές των δεικτών της αιμάτωσης και της ηχητικής υφής των όρχεων των κριών σε ετήσια βάση, και παράλληλα διερευνήθηκε η επίδραση των παραγόντων που επηρεάζουν την αιμάτωση και την ηχητική υφή των όρχεων (ηλικία, εποχή, εκσπερμάτιση, ένοιστρη ή άνοιστρη περίοδος). Τέλος, διερευνήθηκε η ύπαρξη συσχέτισης των δεικτών αιμάτωσης και ηχητικής υφής των όρχεων με τα ποιοτικά χαρακτηριστικά του σπέρματος κριών διαφορετικής ηλικίας, κατά τη διάρκεια τόσο της ένοιστρης όσο και της άνοιστρης περιόδου. Ο πειραματισμός διεξήχθη στη Μονάδα Βιοτεχνολογίας Αναπαραγωγής της Κλινικής Παραγωγικών Ζώων του Τμήματος Κτηνιατρικής Α.Π.Θ. και στο Ινστιτούτο Αναπαραγωγής και Τεχνητής Σπερματέγχυσης της Διεύθυνσης Κτηνιατρικού Κέντρου Θεσσαλονίκης. Η μελέτη πραγματοποιήθηκε σε 7 κριούς-σπερματοδότες φυλής Χίου, οι οποίοι κατανεμήθηκαν σε δύο ομάδες, ανάλογα με την ηλικία τους: 3 κριοί 2-6 ετών (ενήλικοι) και 4 κριοί 9-13 ετών (υπερήλικοι). Τα δείγματα σπέρματος συλλέγονταν από κάθε κριό ανά δύο εβδομάδες, κατά τη διάρκεια ενός πλήρους ημερολογιακού έτους (ένοιστρη και άνοιστρη περίοδος). Στο εργαστήριο του Ινστιτούτου πραγματοποιούνταν ο προσδιορισμός του όγκου και της πυκνότητας των δειγμάτων σπέρματος, καθώς και μια αρχική υποκειμενική εκτίμηση της κινητικότητας. Ακολούθως, τα δείγματα έπειτα από αραίωση με το αραιωτικό μέσο Ovixcell® (37o C) σε τελική συγκέντρωση 250x106 σπερματοζωάρια/ml, μεταφέρονταν στη Μονάδα Βιοτεχνολογίας Αναπαραγωγής, όπου εφαρμόζονταν οι κατάλληλες δοκιμές για την εκτίμηση των εξής παραμέτρων: (i) κινητικότητα και επιμέρους μορφές κίνησης των σπερματοζωαρίων (CASA), (ii) ζωτικότητα του σπέρματος (χρώση εωσίνης-νιγροσίνης), (iii) μορφολογία των σπερματοζωαρίων (χρώση SpermBlue), (iv) αντοχή των σπερματοζωαρίων έναντι της καταπόνησης σε υπό-ωσμωτικό διάλυμα (Hypo-osmotic swelling test, HOST) και (v) ακεραιότητα της χρωματίνης του πυρήνα (DNA) των σπερματοζωαρίων (δοκιμή της πορτοκαλόχρωμης ακριδίνης). Η διά των υπερήχων εξέταση πραγματοποιήθηκε με τη χρήση του φορητού υπερηχοτομογράφου Esaote MyLab™One, με ηχοβόλο κεφαλή γραμμικής σάρωσης 7,5 MHz. Η εξέταση περιλάμβανε τόσο την απεικόνιση με τη B-mode τεχνική, όσο και την απεικόνιση με την τεχνική του παλμικού Doppler. Οι εξετάσεις με τις τεχνικές B-mode και Doppler πραγματοποιούνταν 24 ώρες πριν και αμέσως μετά την εκσπερμάτιση των κριών, σε κάθε όρχη ξεχωριστά. Ειδικότερα, οι αιμοδυναμικοί δείκτες οι οποίοι εκτιμήθηκαν, είναι: (i) ο Δείκτης παλμικότητας (Pulsatility index-PI), (ii) ο Δείκτης αντίστασης (Resistive index-RI), (iii) η Τελοδιαστολική ταχύτητα ροής (End-diastolic velocity-EDV), (iv) η Διάμετρος της ορχικής αρτηρίας (Diameter-D), (v) η Μέγιστη ταχύτητα ροής αίματος στη διάρκεια ενός καρδιακού κύκλου (Time-averaged maximum velocity-TAVM) και (vi) ο Όγκος ροής αίματος (Blood flow volume-BFV). Οι παράμετροι της ηχητικής υφής των όρχεων οι οποίες εκτιμήθηκαν, είναι: (i) η Εντροπία (Entropy-E), (ii) η Αντίθεση (Contrast-Con), (iii) η Συσχέτιση (Correlation-Cor), (iv) η Διασπορά φωτεινότητας (Gradient variance-GV), (v) η Τυπική απόκλιση φωτεινότητας (Standard deviation-StD), (vi) η Έμφαση μακρών διαδρομών (Long run emphasis-LRunEm), (vii) η Μέση τιμή έντασης της φωτεινότητας (Mean value-MV), (viii) η Κατανομή επιπέδων του γκρι (Gray value distribution-GVD), (ix) η Κατανομή μήκους διαδρομών (Runlength distribution-RunLD) και (x) η Μέση τιμή φωτεινότητας (Gradient mean value-GMV). Σε ό,τι αφορά στα αποτελέσματα της ανάλυσης της επίδρασης της εποχικότητας στα ποιοτικά χαρακτηριστικά του σπέρματος, το ποσοστό των ενεργοποιημένων σπερματοζωαρίων παρατηρήθηκε αυξημένο κατά τη διάρκεια της άνοιστρης περιόδου (p=0,011). Επιπλέον, το ποσοστό των σπερματοζωαρίων που έφεραν ανωμαλίες στην κεφαλή τους ήταν υψηλότερο κατά την άνοιστρη περίοδο (p=0,001), ενώ το ποσοστό των σπερματοζωαρίων που έφεραν ανωμαλίες στην ουρά τους βρέθηκε υψηλότερο κατά την ένοιστρη, σε σύγκριση με την άνοιστρη περίοδο (p=0,022). Παράλληλα, το ποσοστό των HOST+ σπερματοζωαρίων καταγράφηκε αυξημένο κατά την ένοιστρη έναντι της άνοιστρης περιόδου (p<0,001). Η ηλικία των κριών φάνηκε να επηρεάζει μόνο τον όγκο και την πυκνότητα του σπέρματος, παρατηρώντας αυξημένες τιμές στην ομάδα των υπερήλικων κριών σε σύγκριση με την ομάδα των ενήλικων (p=0,001 και p<0,001, αντίστοιχα). Οι τιμές των αιμοδυναμικών δεικτών και των παραμέτρων της ηχητικής υφής των όρχεων των κριών δεν μεταβλήθηκαν σημαντικά μετά από την εκσπερμάτιση (p>0,05). Η διερεύνηση της επίδρασης της εποχικότητας στην αιμάτωση των όρχεων, οδήγησε σε υψηλότερες τιμές των δεικτών αντίστασης και παλμικότητας και των δύο όρχεων, τόσο πριν όσο και μετά την εκσπερμάτιση, κατά την ένοιστρη περίοδο συγκριτικά με την άνοιστρη (p<0,001). Επιπλέον, η διάμετρος της ορχικής αρτηρίας του αριστερού μόνο όρχη, καταγράφηκε μεγαλύτερη κατά την άνοιστρη περίοδο, σε σύγκριση με την ένοιστρη, πριν από την εκσπερμάτιση (p=0,012), αποτέλεσμα το οποίο διαπιστώθηκε και για την παράμετρο BFV (p<0,001). Σε ό,τι αφορά στην επίδραση της ηλικίας των κριών στην αιμάτωση των όρχεων, η διάμετρος της ορχικής αρτηρίας του δεξιού όρχη διαπιστώθηκε μεγαλύτερη στους υπερήλικες κριούς, τόσο πριν όσο και μετά την εκσπερμάτιση (p=0,038 και p<0,001, αντίστοιχα), ενώ του αριστερού όρχη, ήταν σημαντικά μεγαλύτερη μόνο μετά την εκσπερμάτιση (p=0,005). Επιπρόσθετα, ο δείκτης BFV του αριστερού όρχη παρατηρήθηκε μεγαλύτερος μετά την εκσπερμάτιση, στους υπερήλικες κριούς, σε σύγκριση με τους ενήλικες (p<0,001).Διερευνώντας τις εποχικές και ηλικιακές μεταβολές της αιμάτωσης και της ηχητικής υφής των όρχεων των κριών, διαπιστώθηκε ότι η τιμή της παραμέτρου GV του αριστερού όρχη πριν από την εκσπερμάτιση, ήταν μειωμένη κατά την ένοιστρη, συγκριτικά με την άνοιστρη περίοδο (p=0,01). Η τιμή της παραμέτρου Cor του αριστερού όρχη πριν την εκσπερμάτιση, καταγράφηκε μεγαλύτερη κατά την ένοιστρη, συγκριτικά με την άνοιστρη περίοδο (p=0,03). Παράλληλα, πριν την εκσπερμάτιση, οι τιμές των παραμέτρων Con και Cor του δεξιού όρχη διαπιστώθηκαν αυξημένες στην ομάδα των υπερήλικων κριών, ενώ μετά την εκσπερμάτιση, η τιμή της παραμέτρου Ent του δεξιού όρχη παρατηρήθηκε υψηλότερη στην ομάδα των ενήλικων κριών (p=0,03, p=0,05 και p=0,05, αντίστοιχα). Σχετικά με τη διερεύνηση της συσχέτισης μεταξύ των παραμέτρων του σπέρματος και της αιμάτωσης των όρχεων, διαπιστώθηκε ότι ο δείκτης παλμικότητας του αριστερού όρχη των ενήλικων κριών συσχετίσθηκε αρνητικά με τη συγκέντρωση των σπερματοζωαρίων, μετά την εκσπερμάτιση, κατά την ένοιστρη περίοδο (r=-0,5, n=33, p=0,003). Επιπλέον, ο δείκτης αντίστασης και των δύο όρχεων, συσχετίσθηκε αρνητικά πριν την εκσπερμάτιση με τις συνολικές μορφολογικές ανωμαλίες (r=-0,5, n=33, p=0,008/r=-0,4, n=33, p=0,01, αντίστοιχα) και με τις ανωμαλίες της ουράς των σπερματοζωαρίων (r=-0,5, n=33, p=0,004/p=0,008, αντίστοιχα). Κατά την άνοιστρη περίοδο, ο δείκτης παλμικότητας του αριστερού και ο δείκτης αντίστασης του δεξιού όρχη των ενήλικων κριών πριν την εκσπερμάτιση, συσχετίσθηκαν θετικά με τον όγκο του εκσπερματίσματος (r=0,4, n=45, p=0,013 και r=0,6, n=45, p<0,001, αντίστοιχα). Οι δείκτες LRunEm, GVD και RunLD του δεξιού όρχη των υπερήλικων κριών συσχετίσθηκαν αρνητικά κατά την ένοιστρη περίοδο αμέσως μετά την εκσπερμάτιση, με τη βλάβη του DNA των σπερματοζωαρίων (r=-0,9, n=44, p<0,001). Σε ό,τι αφορά στους ενήλικες κριούς, μόνο ο δείκτης LRunEm του δεξιού όρχη συσχετίσθηκε αρνητικά με τη συγκεκριμένη παράμετρο του σπέρματος, πριν την εκσπερμάτιση (r=-0,6, n=33, p=0,001). Επιπλέον, στην ίδια ομάδα κριών, κατά την άνοιστρη περίοδο, ο δείκτης LRunEm του αριστερού όρχη συσχετίσθηκε αρνητικά με τις ανωμαλίες της ουράς και τις συνολικές μορφολογικές ανωμαλίες των σπερματοζωαρίων (r=-0,8/r=-0,7, n=45, p<0,001). Επιπρόσθετα, ο δείκτης Con συσχετίστηκε κατά τη διάρκεια της άνοιστρης περιόδου μετά την εκσπερμάτιση, με τα ακίνητα και τα ζωντανά σπερματοζωάρια (r=-0,6/r=0,6, n=60, p<0,001). Συνοψίζοντας, η ολοκλήρωση της παρούσας διατριβής οδήγησε στα ακόλουθα συμπεράσματα: (i) η εποχικότητα επηρεάζει ορισμένα ποιοτικά χαρακτηριστικά του σπέρματος (WOB, υπερκινητικότητα, ανωμαλίες κεφαλής και ουράς των σπερματοζωαρίων, αντοχή των σπερματοζωαρίων έναντι της καταπόνησης σε υπό-ωσμωτικό διάλυμα), (ii) η ποιότητα του σπέρματος των υπερήλικων κριών διατηρείται σε υψηλά επίπεδα, καθιστώντας χρήσιμη την παραμονή τους στα ποίμνια, (iii) οι τιμές των αιμοδυναμικών δεικτών και των παραμέτρων της ηχητικής υφής των όρχεων των κριών δεν μεταβάλλονται σημαντικά μετά την εκσπερμάτιση, (iv) οι κύριοι δείκτες της αιμάτωσης των όρχεων (PI, RI) επηρεάζονται από την εποχικότητα, αλλά όχι από την ηλικία των κριών, (v) οι τιμές ορισμένων μόνο παραμέτρων της ηχητικής υφής των όρχεων επηρεάζονται από την εποχικότητα και την ηλικία των κριών (GV, Cor, Con, Ent), (vi) οι μεταβολές της αιμάτωσης και της ηχητικής υφής των όρχεων εμφανίζουν μέτριας ισχύος συσχέτιση με τις παραμέτρους του σπέρματος, υπό την επίδραση των παραγόντων της εποχής, της εκσπερμάτισης και της ηλικίας των κριών και (vii) αποδεικνύεται η χρησιμότητα της διά των υπερήχων εξέτασης των όρχεων με τις τεχνικές B-mode και Doppler για την παροχή πρόσθετων πληροφοριών, οι οποίες σε συνδυασμό με την εργαστηριακή ανάλυση του σπέρματος, συμβάλλουν στην ασφαλέστερη επιλογή κατάλληλων κριών για την αναπαραγωγική διαδικασία.