Δευτερογενείς μεταβολίτες του φυτού Cedrus brevifolia: έλεγχος αντιοξειδωτικής και αντιφλεγμονώδους δράσης

Abstract

The present thesis is an in-depth study of the chemical profile of C. brevifolia (Hook.f.) Elwes & A. Henry (Pinaceae) and seeks on the detailed phytochemical analysis of the secondary metabolites that appear to have been overlooked in the only prior study on this species (Creţu et al., 2013). Formerly, C. brevifolia was considered as a subspecies of C. libani A. Rich. The present study contributes to the chemotaxonomic study of C. brevifolia in comparaison to the other Cedrus species and more specifically to C. libani. In the present investigation were carried out the following: Phytochemical analysis, i.e. isolation and structure elucidation of the secondary metabolites from the:- dichloromethane, methanol, methanol: H2O (5:1) needle extracts,- cyclohexane, dichloromethane, methanol bark extracts- cyclohexane, ethanol, ethanol: H2O: (1:1) resin extracts. In vitro biological assays for the evaluation of the antioxidant and anti-inflammatory activities of the extracts and the isolated secondary metabolites, as cedar products have been traditionally used in several inflammation-related diseases, since antiquity. Analysis of the volatile constituents of the resin, as well as of the heartwood and sapwood of the trunk. Dendrochronology of Cedrus brevifolia. In total, 40 secondary metabolites were isolated:I. Dichloromethane extract of needles:Eight diterpenes and one phytosterol were isolated and identified: manoyl oxide (3), phytyl acetate (4), dehydroabietic acid (5), dehydroabietinal (6), methyl dehydroabietate (7), 9,13α-epidioxy-8(14)-abieten-18-oic acid (8), 13-hydroxy-8,11,13-podocarpatrien-18-oic acid (9), 15-hydroxy-dehydroabietic acid (10), (3β,24R)-campesterol (11)II. Methanol extract of needles:Eleven phenolic derivatives, one apocarotenoid and three flavonoids and one tannin were isolated and identified:trans-p-coumaric acid (13), p-coumaroyl-4-Ο-β-D-glucoside (17), p-anisic acid (18), trans-vaginoside (19), benzoate glucoside (20), benzyl-β-D-glucoside (21), benzyl-β-D-rutinoside (22), 2-methoxy-phenyl-β-D-glucoside (23), 3,4-dimethoxyphenyl-β-D-glucoside (24), β-D- glucoside of raspberry ketone (25), 4-hydroxybenzoic acid 4-O-β-D-glucoside (26), abscisic alcohol- β-D-glucoside (12), astragalin (29), isorhamnetin 3-O-β-D-glucoside (30), taxifolin (36), (-) (2S,3R)-catechin (40)III. Methanol: Η2Ο (5:1) extract of needles:four flavonoids were isolated and identified:nicotiflorin (31), kaempferide-3-O- β-rutinoside (32), tiliroside (33), syringetin-3-Ο-β-D-glucoside (34)IV. Dichloromethane extract of bark:One phenolic acid was isolated and identified: (E)-ferulic acid (15), which was the main secondary metabolite of the extractV. Methanol extract of bark: Two phenolic acids, two flavonoids and one hydrolyzed chalcone were isoalated and identified: (E)-ferulic acid (15), syringic acid (16), quercetin (28), eriodictyol (35), cilicione-b (37)VI. Cyclohexane extract of resin: Three diterpenes were isolated and identified:manool (1), 3β-hydroxy-manool (2), dehydroabietic acid (5)VII. Ethanol extract of resin: Two phenolic compounds and two lignans were isolated and identified:(E)-caffeic acid (14), dibutyl phthalate (27), (+) lariciresinol (38), (+) 9-acetyl-lariciresinol (39)VIII. Ethanol: Η2Ο (1:1) of resin:One phenolic derivative was isolated and identified: (+) lariciresinol (38)In a previous study, Crețu et al. (2013) reported the presence only of substances 36 and 40 in C. brevifolia bark, detected by HPLC-DAD-ESI-MS. The extracts and the isolated compounds were tested in vitro for their antioxidant and anti-inflammatory activity. The methanol, methanol: H2O (5: 1) extracts of the needles, the bark methanol extract, the ethanol and ethanol: H2O (1: 1) resin extracts showed positive antioxidant effects in all biological tests. In particular, the bark methanol extract, the resin ethanol and the ethanol: H2O (1:1) extracts interacted with the free radical DPPH and exhibited better reducing ability compared to the reference compound (NDGA) 93 %, 89% and 85%, respectively. Moreover, all of them presented strong inhibition of the linoleic acid induced sodium peroxidation (AAPH) at 97% 100% and 84% compared to the reference compound (trolox). As for the anti-inflammatory activity based to the inhibition of soybean lipoxygenase (LOX), the bark methanol extract was the most active (80%). The isolated compounds submitted to the same biological assays exhibited different levels of bioactivity. Among them, 14, 17, 40, 28, 35, 36, 37, 38, 39 showed remarkable interaction with DPPH, while 1, 14, 17, 35, 39 were the most potent against LOX inhibition. Substances 17, 38, 39 exhibited inhibition of AAPH-induced sodium hydroxide peroxidation. The results corroborate to the ethnopharmacological uses of the plant.Qualitative and quantitative analysis of the volatile constituents by GC-MS of the trunk segments, as well as of the resin, revealed the presence of sixteen compounds in the heartwood, fourteen compounds in sapwood covering 93.2% and 99.5%, respectively, while seven compounds were found in the resin in percentage of 99.9% of its total volatile constituents, all of them belonging to the terpenoids. During tree dating, a thick disc of C. brevifolia wood was examined. Being only 52 years old and in comparison, to the age that Cedrus species can reach, was rather young when cut. The last two processes, the dendrochronology and the qualitative and quantitative analysis of the volatile constituents of the trunk and resin, were performed in order to correlate its age with the biosynthesis of volatile secondary metabolites.

Η παρούσα εργασία είναι μία σε βάθος μελέτη του χημικού περιεχομένου του φυτού Cedrus brevifolia (Hook.f.) Elwes & A. Henry της οικογένειας Pinaceae και επιχειρεί να ρίξει φως και στις εμπεριεχόμενες φυτοχημικές ομάδες, που φαίνεται να έχουν αγνοηθεί στη μοναδική προηγούμενη μελέτη στο είδος αυτό (Crețu et al., 2013). Μέχρι πρόσφατα, το είδος C. brevifolia θεωρείτο υποείδος του C. libani A. Rich. Η παρούσα μελέτη συμβάλλει στη χημειοταξινομική σύγκριση των δύο προαναφερθέντων ειδών. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή διεξήχθησαν τα ακόλουθα: Φυτοχημική ανάλυση, ήτοι απομόνωση και ταυτοποίηση των δευτερογενών μεταβολιτών με στόχο τον χαρακτηρισμό του χημικού φορτίου των εκχυλισμάτων:- διχλωρομεθανίου, μεθανόλης, μεθανόλης: H2O (5:1) των βελονών- διχλωρομεθανίου, μεθανόλης του φλοιού- κυκλοεξανίου, αιθυλικής αλκοόλης, αιθυλικής αλκοόλης: H2O (1:1) της ρητίνης. Έλεγχος της αντιοξειδωτικής και αντιφλεγμονώδους δράσης των εκχυλισμάτων και των δευτερογενών μεταβολιτών που απομονώθηκαν, δεδομένου ότι παραδοσιακά τα διάφορα είδη Κέδρου έχουν χρησιμοποιηθεί σε διάφορες παθήσεις σχετιζόμενες με την φλεγμονή. Ποιοτική και ποσοτική ανάλυση πτητικών συστατικών των τμημάτων του κορμού και της ρητίνης C. brevifolia Δενδροχρονολόγηση του δέντρου C. brevifolia. Συνολικά απομονώθηκαν 40 δευτερογενείς μεταβολίτες: Ι. Διχλωρομεθανικό εκχύλισμα βελονών: Απομονώθηκαν και ταυτοποιήθηκαν οκτώ διτερπένια και μια φυτοστερόλη: οξείδιο της μανοόλης-(13R) (3), ακετυλο-φυτόλη (4), δεϋδρο-αβιετικό οξύ (5), δεϋδρο-αβιετάλη (6), δεϋδρο-αβιετικός μεθυλεστέρας (7), 9,13α-επι-διοξο-8(14)-αβιετεν-18-οϊκό οξύ (8), 13-υδροξυλο-8,11,13-ποδοκαρπατριεν-18-oϊκό οξύ (9), 15-υδροξυ-δεϋδρο-αβιετικό-οξύ (10), καμπεστερόλη (11)ΙΙ. Μεθανολικό εκχύλισμα βελονών:Απομονώθηκαν και ταυτοποιήθηκαν ένα αποκαροτενοειδές, έντεκα φαινολικά παράγωγα και τρία φλαβονοειδή και μία ταννίνη:15-Ο-β-D-γλυκοπυρανοσυλο-αμπσισική αλκοόλη (12), trans-π-κουμαρικό οξύ (13), π-κουμαροϋλο 4-Ο-β-D-γλυκοσίδης (17), π-ανισικό οξύ (18), trans-βαγγινοσίδης (19), β-D-γλυκοσυλοξυλο-βενζοϊκό οξύ (20), βενζυλο-β-D-γλυκοπυρανοσίδης (21), βενζυλο-β-D-ρουτινοσίδης (22), γουαϊακυλο-β-D-γλυκοπυρανοσίδης (23), 3,4-διμεθοξυ-φαινυλο-1-β-D-γλυκοπυρανοσίδης (24), β-D-γλυκοπυρανοσυλο-φαινυλο-βουταν-2-όνη (25), 4-β-D-γλυκοπυρανοσυλο-4-υδροξυ-βενζοϊκό οξύ (26), αστραγαλίνη (29), ισοραμνετινο-3-Ο-β-D-γλυκοπυρανοσίδης (30), ταξιφολίνη (36), (-) (2S,3R)-κατεχίνη (40).ΙΙΙ. Εκχύλισμα μεθανόλης:Η2Ο (5:1) βελονώνΑπομονώθηκαν και ταυτοποιήθηκαν τέσσερα φλαβονοειδή:νικοτιφλορίνη (31), καιμπφεριδο-3-Ο-β-D-ρουτινοσίδης (32), τιλιροσίδης (33) συριγγετινο-3-Ο-β-D-γλυκοπυρανοσίδης (34)ΙV. Διχλωρομεθανικό εκχύλισμα φλοιούΑπομονώθηκε και ταυτοποιήθηκε ένα φαινολοξύ: (E)-φερουλικό οξύ (15)V. Μεθανολικό εκχύλισμα φλοιούΑπομονώθηκαν και ταυτοποιήθηκαν δύο φαινολικά οξέα, δύο φλαβονοειδή και μια διυδρο-χαλκόνη:(E)-φερουλικό οξύ (15), συριγγικό οξυ (16), κερκετίνη (28), εριοδικτυόλη (35), σιλισιόνη-β (37)VI. Κυκλοεξανικό εκχύλισμα ρητίνηςΑπομονώθηκαν και ταυτοποιήθηκαν τρία διτερπένια:μανοόλη (1), 3β-υδροξυ-μανοόλη (2), δεϋδρο-αβιετικό οξύ (5)VII. Εκχύλισμα αιθυλικής αλκοόλης ρητίνηςΑπομονώθηκαν και ταυτοποιήθηκαν δύο φαινολικά παράγωγα και δύο λιγνάνια:(E)-καφεϊκό οξύ (14), διβουτυλο- φθαλικός εστέρας (27), (+) λαρισιρεσινόλη (38), (+) 9-ακετυλο-λαρισιρεσινόλη (39)VIII. Εκχύλισμα αιθυλικής αλκοόλης: Η2Ο (1:1) ρητίνης. Απομονώθηκε και ταυτοποιήθηκε ένα λιγνάνιo: (+) λαρισιρεσινόλη (38)Από τους παραπάνω δευτερογενείς μεταβολίτες, οι 22 δεν έχουν απομονωθεί έως τώρα στο γένος Cedrus Trew: 2, 3, 4, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 16, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 35, 37, 39.Όσον αφορά την προγενέστερη μελέτη στο είδος C. brevifolia (Crețu et al., 2013), οι μεταβολίτες 36 και 40 είχαν ανιχνευθεί με HPLC-DAD-ESI-MS στο υδατοαλκοολικό εκχύλισμα του φλοιού. Τα εκχυλίσματα και οι απομονωμένες ουσίες ελέγχθηκαν in vitro ως προς την αντιοξειδωτική και αντιφλεγμονώδη δράση τους. Τα εκχυλίσματα μεθανόλης, μεθανόλης:Η2Ο (5:1) των βελονών, μεθανόλης του φλοιού, αιθυλικής αλκοόλης και αιθυλικής αλκόλης:Η2Ο (1:1) της ρητίνης έδειξαν θετικά αποτελέσματα ως προς την αντιοξειδωτική δράση σε όλες τις βιολογικές δοκιμές. Ειδικότερα το μεθανολικό εκχύλισμα του φλοιού, το εκχύλισμα αιθυλικής αλκοόλης και αιθυλικής αλκόλης: Η2Ο (1:1) της ρητίνης έδειξαν να αλληλεπιδρούν με την ελεύθερη ρίζα (DPPH) και να παρουσιάζουν καλύτερη ανασταλτική ικανότητα συγκριτικά με την ένωση αναφοράς (NDGA) σε ποσοστά 93%, 89% και 85%, αντίστοιχα. Επίσης, ανέστειλαν την υπεροξείδωση του μετά νατρίου άλατος του λινελαϊκού οξέος, που επάγεται από το (AAPH) σε ποσοστά 97%, 100% και 84% συγκριτικά με την ένωση αναφοράς (trolox). Ως προς την αντιφλεγμονώδη δράση μέσω της αναστολής της φυτικής λιποξυγονάσης (LOX), το εκχύλισμα μεθανόλης του φλοιού ήταν το πιο δραστικό σε ποσοστό 100%. Τα παραπάνω αποτελέσματα οδήγησαν στη διερεύνηση των δευτερογενών μεταβολιτών που είναι υπεύθυνοι για τις δράσεις αυτές.Οι ουσίες 14, 17, 28, 35, 36, 37, 38, 39, 40 έδειξαν αλληλεπίδραση με την σταθερή ρίζα DPPH, ενώ αναστολή της φυτικής λιποξυγονάσης (LOX) εμφάνισαν μόνο οι ουσίες 1, 14, 17, 35, 39. Οι ουσίες 17, 38, 39 εμφάνισαν αναστολή της υπεροξείδωσης του μετά νατρίου άλατος του λινελαϊκού οξέος, που επάγεται από το AAPH. Η ποιοτική και ποσοτική ανάλυση των πτητικών συστατικών των τμημάτων του κορμού, καθώς και της ρητίνης με GC-MS, ταυτοποιήθηκαν δεκαέξι ενώσεις στο εγκάρδιο τμήμα, δεκατέσσερεις ενώσεις στο σομφό που καλύπτουν 93.2% και 99.5% αντίστοιχα, ενώ επτά ενώσεις βρέθηκαν στη ρητίνη σε ποσοστό 99.9%, των συνολικών πτητικών συστατικών του. Κατά την δενδροχρονολόγηση, έγινε εξέταση ενός δίσκου ξύλου από τον κορμό του C. brevifolia και διαπιστώθηκε ότι το δέντρο ήταν μόλις 52 ετών όταν κόπηκε. Με βάση τη διάρκεια ζωής του γένους Cedrus Trew, το δικό μας δείγμα μπορεί να χαρακτηριστεί ως έφηβος. Οι δύο τελευταίες διεργασίες, της δενδροχρονολόγησης και της ποιοτικής και ποσοτικής ανάλυση πτητικών συστατικών των τμημάτων του κορμού έγιναν με σκοπό τη συσχέτιση της ηλικίας του δέντρου με την βιοσύνθεση πτητικών δευτερογενών μεταβολιτών.