Ιστικός και ποσοτικός προσδιορισμός των TLRs στο έντερο και στους νεφρούς σε σηπτικά μοντέλα μυών: πειραματική μελέτη

Abstract

Toll-like receptors (TLRs) are key regulators of innate and adaptive immunity and are highly expressed during sepsis. Thus, studying the expression of TLRs in an animal septic model might indicate their possible association with acute kidney injury (AKI) in sepsis. Methods: Seventy-two male C57BL/6J mice were used for this study. Randomly, these animals were divided into 6 groups (N=12/group): 3 control and 3 septic groups depending on the euthanasia time (24h, 48h, 72h). Septic groups underwent cecal ligation and puncture (CLP) to induce peritonitis, while control groups had a sham operation. Hematological tests were performed in serum for immune biomarkers; immunofluorescence (IF), morphometry and qRT-PCR analysis was used on both kidney and intestine tissues to evaluate the expression of TLRs 2, 3, 4 and 7 in a septic process. Results: At the end of each experimental period, we found that TLRs 2, 3, 4 and 7 were expressed in both tissues but there were differences between those at various time points. Also, we found that mRNA levels were significantly higher in qRT-PCR evaluation in septic groups than control groups in both kidney and intestinal tissues; showing a steady increase in the septic groups as time to euthanasia was prolonged (p<0.05). Conclusion: Overall, our study provides a suggestion that TLRs 2, 3, 4 and 7 are highly increased in the kidneys of septic mice and especially, that these TLRs are sensitive and specific markers for sepsis. Finally, our study supports the diagnostic importance of TLRs in AKI and provides new data about them in septic mice models and in multi organ dysfunction syndrome (MODS) in general.

Οι υποδοχείς τύπου Toll (TLRs) είναι βασικοί ρυθμιστές της φυσικής και επίκτητης ανοσίας και εκφράζονται έντονα κατά τη διάρκεια της σηψαιμίας. Έτσι, η μελέτη της έκφρασης των TLRs σε ένα ζωικό μοντέλο σήψης μπορεί να υποδεικνύει την πιθανή τους συσχέτιση με την οξεία νεφρική ανεπάρκεια (ΟΝΑ) σε μια σηπτική κατάσταση. Υλικό-Μέθοδοι: Σε αυτή τη μελέτη χρησιμοποιήθηκαν 72 αρσενικοί μύες C57BL/6J. Τυχαία, τα ζώα χωρίστηκαν σε 6 ομάδες (N = 12/ομάδα): 3 ομάδες ελέγχου και 3 σηπτικές ομάδες ανάλογα με το χρόνο ευθανασίας (24 ώρες, 48 ώρες και 72 ώρες). Οι σηπτικές ομάδες υποβλήθηκαν σε διαδικασία απολίνωσης και διάτρησης του τυφλού με βελόνη (CLP) για την πρόκληση περιτονίτιδας, ενώ οι ομάδες ελέγχου υποβλήθηκαν σε πλασματική επέμβαση. Διεξήχθησαν αιματολογικές εξετάσεις στον ορό για ανίχνευση βιοδεικτών ανοσίας. Τα αποτελέσματα του ανοσοφθορισμού (IF), της μορφομετρίας και της ποσοτικής αντίδρασης αλυσίδας πολυμεράσης πραγματικού χρόνου (qRT-PCR) αξιολογήθηκαν σε νεφρικούς και εντερικούς ιστούς για την έκφραση των TLR 2, 3, 4 και 7 κατά τη διάρκεια της σήψης. Αποτελέσματα: Στο τέλος κάθε πειραματικής περιόδου, διαπιστώσαμε ότι οι TLRs 2, 3, 4 και 7 εκφράζονται και στους δύο ιστούς με διαφορές τόσο μεταξύ τους όσο και μεταξύ των χρονικών σημείων. Επίσης βρήκαμε ότι τα επίπεδα του mRNA ήταν σημαντικά υψηλότερα στην αξιολόγηση της qRT-PCR στις σηπτικές ομάδες από ό,τι στις ομάδες ελέγχου τόσο στους νεφρούς όσο και στους εντερικούς ιστούς, παρουσιάζοντας μια σταθερή αύξηση στις σηπτικές ομάδες καθώς ο χρόνος ευθανασίας παρατείνετο (p <0,05). Συμπέρασμα: Συνολικά, η μελέτη μας υποστηρίζει ότι η έκφραση των TLRs 2, 3, 4 και 7 εκφράζεται σε μεγάλο βαθμό στους νεφρούς των σηπτικών μυών και ειδικότερα ότι αυτοί οι TLRs είναι ευαίσθητοι και ειδικοί δείκτες για τη σηψαιμία. Επίσης, η μελέτη μας ενισχύει τη διαγνωστική σημασία των TLRs στην ΟΝΑ καιπαρέχει νέα δεδομένα για αυτούς σε μοντέλα σηπτικών μυών και κατά επέκταση στην ανεπάρκεια πολλαπλών οργάνων (MODS).