Μελέτη του ρόλου των επιγενετικών και επιδιορθωτικών μηχανισμών στη ρύθμιση της γονιδιακής έκφρασης

Abstract

The integrity of the DNA sequence is constantly challenged by a variety of genotoxic perturbations. Nucleotide Excision Repair (NER), via its two subpathways, plays a vital role in sensing and removing a large panel of helix-distorting DNA adducts induced by ultraviolet (UV) light, cigarette smoke, and other chemicals currently used in chemotherapy. Global Genome-NER (GG-NER, GGR) operates through the entire genome and is triggered stochastically by helix distortions, while Transcription Coupled-NER (TC-NER, TCR) is triggered by elongating Pol II molecules encountering DNA adducts and speeds-up damage excision and repair in expressed loci, revealing that transcription is a major driving force in safeguarding genomic stability. High-throughput genome-wide methodologies have revealed that cells cope with DNA damage-induced stress through a multilayered transcription-driven response that involves global alteration of the gene expression program and leads to accelerated repair of transcription-blocking DNA lesions. Nonetheless, the associated molecular events ruling these processes remain elusive. By focusing on normal human skin fibroblasts, we uncovered a surprising gain in chromatin accessibility at virtually all active Transcription Start Sites (TSSs) of mRNAs, PROMoter uPstream Transcripts (PROMPTs) and enhancers in response to UV irradiation. This phenomenon is accompanied by the maintenance of active histone marks (H3K27ac) and the lack of deposition of transcription silencing modifications (H3K27me3) at the respective transcribed loci. Importantly, we revealed the continuous and dynamic recruitment of pre-initiating RNA Polymerase II (Pol II-hypo) at active TSSs and its unrestrained transition into initiation at these regulatory loci, as further demonstrated by the increased synthesis of start-RNAs and the production of high levels of nascent RNAs (nRNAs) proximal to TSS sites, upon genotoxic stress. Our data highlight a dynamic synergy between increased accessibility of proximal and distal transcription regulatory regions and an unanticipated constant initiation process that is unleashed by the UV-triggered release of Pol II molecules from promoter-proximal pause sites. This mechanism secures gene expression accuracy and preserves the integrity of essentially all active transcription regulatory regions. In parallel, we studied the transcription initiation dynamics upon UV stress in CS-B fibroblasts, a cellular model characterized by its inability to restore transcription upon exposure to UV stress. Surprisingly, we observed that H3K27ac is not significantly altered and de novo binding of Pol II-hypo is not inhibited at active TSSs, early after exposure to UV, showing that transcription initiation is not inhibited in CS-B cells at least at the early post recovery times. These results suggest that the inability to restore transcription in these cells derives from aberrations in the way cells handle transcription elongation blockage.Moreover, by comparing non-irradiated normal and CS-B skin fibroblasts, we found that a group of genes implicated in developmental processes was differentially expressed between the two cell lines, while also being differentially targeted by H3K27me3. These results indicate that CSB protein could act as epigenetic regulator, providing possible links between the phenotype and the molecular basis of Cockayne Syndrome.

Τα κύτταρά μας εκτίθενται καθημερινά σε πληθώρα παραγόντων που απειλούν την γονιδιωματική τους ακεραιότητα. Οι βλάβες που προκαλούνται από την υπεριώδη (UV) ακτινοβολία, επιδιορθώνονται από τον μηχανισμό εκτομής βάσης (Nucleotide Excision Repair, NER), ο οποίος αποτελείται από 2 υπό-μονοπάτια: το Global Genome NER (GG-NER), που δρα σε όλο το γονιδίωμα και το Transcription Coupled NER (TC-NER), το οποίο δρα στις ενεργώς μεταγραφόμενες περιοχές, πυροδοτούμενο από το σταμάτημα της RNA πολυμεράσης ΙΙ (Pol II) στις περιοχές των UV επαγόμενων βλαβών, υποδηλώνοντας πως η μεταγραφή μέσω της Pol II διαδραματίζει κομβικό ρόλο στη διατήρηση της γονιδιωματικής ακεραιότητας. Με την εισαγωγή των τεχνολογιών αλληλούχισης νέας γενιάς, βρέθηκε πως τα κύτταρα ανταποκρίνονται στο γενοτοξικό στρες, μέσω μιας πολυεπίπεδης μεταγραφικής αναδιοργάνωσης, η οποία συντελεί στη γρήγορη επιδιόρθωση των UV επαγόμενων βλαβών. Ωστόσο, πολλές λεπτομέρειες του συγκεκριμένου μηχανισμού παρέμειναν αδιευκρίνιστες. Στην παρούσα διατριβή, μελετήθηκε αρχικά η επίδραση της UV ακτινοβολίας στην προσβασιμότητα της χρωματίνης ανθρώπινων ινοβλαστών δέρματος, μέσω της μεθόδου ATAC-seq. Τα αποτελέσματά έδειξαν πως η έκθεση σε UV οδηγεί σε σημαντική αύξηση της προσβασιμότητας της χρωματίνης στις ρυθμιστικές περιοχές του μεταγραφόμενου γονιδιώματος. Η αύξηση αυτή συνάδει με την UV-επαγόμενη απελευθέρωση των μορίων Pol II-ser2P από τις θέσεις παύσης της μεταγραφής πλησίον του υποκινητή, η οποία λαμβάνει χώρα, σε όλες τις ενεργώς μεταγραφόμενες, κωδικές και μη κωδικές, περιοχές του γονιδιώματος. Επιπλέον, πειράματα αλληλούχισης ανοσοκατακρημνισμένης χρωματίνης, σε συνδυασμό με βιοχημικές τεχνικές, έδειξαν ότι τα επίπεδα και η κατανομή της ιστονικής τροποποίησης H3K27ac παραμένουν σταθερά στις περιοχές των σημείων έναρξης της μεταγραφής (Transcription Start Sites, TSS), μετά την έκθεση σε UV. Τα αποτελέσματα αυτά υποδεικνύουν ότι, οι ρυθμιστικές περιοχές των μεταγραφόμενων γονιδιωματικών περιοχών διατηρούν την ενεργότητά τους, μετά από έκθεση σε UV. Ακόμη, βρέθηκε πως η ακτινοβόληση με UV δεν αναστέλλει την πρόσδεση των μορίων Pol II-hypo στις περιοχές TSS των ενεργώς μεταγραφόμενων γενετικών τόπων, αλλά προκαλεί μια γρήγορη μετάβαση των μορίων από το στάδιο μεταγραφικής έναρξης σε αυτό της επιμήκυνσης, οδηγώντας σε μείωση των επιπέδων της Pol II-hypo στους υποκινητές. Διαπιστώθηκε πως η διαδικασία πρόσδεσης-γρήγορης προώθησης λαμβάνει χώρα καθ’ όλη την περιόδο ανάκαμψης των κυττάρων μετά την έκθεση σε UV και επιβεβαιώθηκε πως ταυτόχρονα, τα μόρια Pol II διατηρούν την δυνατότητα να συνθέτουν RNA στις περιοχές πλησίον των TSSs. Επιπλέον, βιοπληροφορική συσχέτιση των δεδομένων μας με δεδομένα αλληλούχισης, τα οποία χαρτογραφούν τα τμήματα του DNA που περιέχουν βλάβες και επιδιορθώνονται μέσω TC-NER, έδειξε πως για την επιτυχή ολοκλήρωση της επιδιόρθωσης και την εξασφάλιση της ακεραιότητας όλου του μεταγραφόμενου γονιδιώματος, απαιτείται συνεχής τροφοδότηση των ενεργών ρυθμιστικών περιοχών, με νέα μόρια Pol II. Συμπερασματικά, η διατήρηση ενεργής κατάστασης της χρωματίνης στα TSS των μεταγραφόμενων κωδικών και μη κωδικών περιοχών μετά την έκθεση σε UV, ευνοεί την πρόσδεση μορίων Pol II και τη γρήγορη προώθησή τους στη φάση επιμήκυνσης, τροφοδοτώντας ένα μεταγραφικό κύμα, το οποίο σαρώνει το ενεργώς μεταγραφόμενο γονιδίωμα, ανιχνεύοντας και επιδιορθώνοντας τις UV επαγόμενες βλάβες. Παράλληλα, μελετήθηκαν οι δυναμικές έναρξης της μεταγραφής μετά από έκθεση σε UV σε ινοβλάστες δέρματος ασθενών CS-B. Βρέθηκε πως η πρόσδεση της Pol II στους υποκινητές των ενεργών γονιδίων δεν αναστέλλεται και πως η τροποποίηση H3K27ac παραμένει σε σταθερά επίπεδα στις περιοχές αυτές. Τα συγκεκριμένα δεδομένα υποδηλώνουν πως η ανικανότητα επανεκκίνησης της μεταγραφής στους ινοβλάστες CS-B, δεν οφείλεται σε μόνιμη αναστολή της μεταγραφικής έναρξης αλλά στην αδυναμία διαχείρισης του σταματήματος της μεταγραφικής επιμήκυνσης στις περιοχές των βλαβών. Τέλος, αρκετά γονίδια σχετιζόμενα με διαδικασίες κυτταρικής ανάπτυξης και διαφοροποίησης, παρουσιάζουν ταυτόχρονα διαφορική έκφραση και στόχευση από την τροποποίηση H3K27me3, συγκρίνοντας μη ακτινοβολημένους φυσιολογικούς και CS-B ινοβλάστες δέρματος. Τα παραπάνω συνδέουν την πρωτεΐνη CSB με τις διαδικασίες της ορθής επιγενετικής ρύθμισης της γονιδιακής έκφρασης.