Μελέτη της θεραπευτικής επίδρασης της σιλοσταζόλης στη φλεγμονώδη απόκριση και την εξέλιξη της ισχαιμίας άκρου σε μύες

Abstract

Introduction: Angiogenesis is a physiological process involving the growth of new blood vessels from pre-existing vessels, with macrophages, and T cells playing an important role in the development of this phenomenon. These cells are also affected by various drugs administered for the treatment of diseases related to the pathological obstruction of blood vessels which, initially target molecules, like the phosphodiesterase inhibitor family.Cilostazol is a selective inhibitor of phosphodiesterase 3A (PDE-3Α), with proven effectiveness in the treatment of intermittent claudication (IC), increasing the distance walked by patients with IC. The drug acts on platelets, vascular smooth muscle cells and endothelial cells by increasing the levels cyclic adenosine monophosphate (cAMP) via the concomitant intracellular PDE-3A inhibition and extracellular adenosine uptake. Using a Peripheral Arterial Disease (PAD) mouse model, the purpose of this study was to investigate the revascularization of ischemic muscles after the induction of surgical hind limb ischemia, as well as the interactions between cilostazol and innate immunity cells, and the effects of the drug on the profile of cytokines produced. Methods: A total of 108 NOD.CB17-Prkdcscid/J and 108 CB17 male mice were used. All animals underwent hind limb ischemia. At the day of surgery (D0), 60 mg/kg of cilostazol were administered to all animals which continued receiving a daily dosage of 30 mg/kg for the next 7 postoperative days. Vehicle was administered daily in the control groups. Serum concentrations of IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17A, TNF and IFN-gamma were measured by flow cytometry on post-surgery days D1, D3, D5, and D7. On D7 Post-mortem Analysis was performed after the administration of 68Ga-RGD. The gastrocnemius muscle was obtained for histological evaluation. Key findings: There was a statistically significant augmentation (p < 0.05) in the concentrations of IL-4, IL-10, IL-6 and IFN-g in cilostazol treated wild type animals while IL-2 was significantly suppressed. In treated immunodeficient animals, TNF, IL-6 and IFN-g presented significant augmentation while the uptake of 68Ga-NODAGA-RGDfK was found significantly lower for both legs in comparison with the control group. No significant difference in the uptake of 68Ga-NODAGA-RGDfK was found in wild type animals.Significance: Cilostazol seems to significantly influence immunity cells in cytokine production altering the type of immunity response by promoting the production of anti-inflammatory cytokines in wild type animals while it helps toward the improvement of immunity response in immunodeficient animals. Conclusions: In conclusion, cilostazol seems to significantly impact on immune cells, mainly affecting cytokine production, thus altering the type of immune response; cilostazol seems to promote the production of anti-inflammatory cytokines and the suppression of IL-2 in wild-type animals, while it helps towards the improvement of immune responses in immunodeficient animals by increasing the secretion of proinflammatory cytokines and IFN-γ, an indication that needs to be further investigated. Regarding the effects of cilostazol on angiogenesis, our results indicate reduced expression of αvβ3 integrin and CD31 receptor in immunodeficient mice, while cilostazol seems to significantly increase angiogenesis in wild type animals during the first post operational week.

Εισαγωγή: Η αγγειογένεση είναι μια φυσιολογική διεργασία που αφορά την ανάπτυξη νέων αιμοφόρων αγγείων από προϋπάρχοντα αγγεία. Τα μακροφάγα και τα Τ κύτταρα παίζουν σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη αυτού του φαινομένου. Αυτά τα κύτταρα συχνά επηρεάζονται από ποικίλα φάρμακα που χορηγούνται για τη θεραπεία ασθενειών που σχετίζονται με την παθολογική απόφραξη των αιμοφόρων αγγείων και που στοχεύουν συγκεκριμένα μόρια, όπως της οικογένειας αναστολέων της φωσφοδιεστεράσης. Η σιλοσταζόλη είναι ένας εκλεκτικός αναστολέας της φωσφοδιεστεράσης 3Α (PDE-3Α), με αποδεδειγμένη αποτελεσματικότητα στη θεραπεία της διαλείπουσας χωλότητας (IC), αυξάνοντας σημαντικά την παράταση του χρόνου βάδισης ασθενών με IC. Το φάρμακο δρα στα αιμοπετάλια, τα αγγειακά λεία μυϊκά κύτταρα και τα ενδοθηλιακά κύτταρα, αυξάνοντας τα επίπεδα της κυκλικής μονοφωσφορικής αδενοσίνης (cAMP) μέσω της παράλληλης ενδοκυτταρικής αναστολής του PDE-3Α και της εξωκυτταρικής πρόσληψης αδενοσίνης. Χρησιμοποιώντας ένα μοντέλο περιφερικής αρτηριακής νόσου (PAD) σε ποντικούς, σκοπός της μελέτης ήταν η διερεύνηση της αγγειογένεσης στους ισχαιμούντες γαστροκνήμιους μύες μετά την επαγωγή χειρουργικής ισχαιμίας των οπίσθιων άκρων, καθώς και των αλληλεπιδράσεων μεταξύ της σιλοσταζόλης και των κυττάρων της φυσικής ανοσίας, και των επιδράσεων του φαρμάκου στο προφίλ των παραγόμενων κυτταροκινών. Μέθοδοι: Χρησιμοποιήθηκαν συνολικά 108 NOD.CB17-Prkdcscid/J και 108 CB17 αρσενικοί ποντικοί. Όλα τα ζώα υποβλήθηκαν σε χειρουργική ισχαιμία των πίσω άκρων. Την ημέρα της χειρουργικής επέμβασης (D0) χορηγήθηκαν 60 mg/kg σιλοσταζόλης σε όλα τα ζώα και τα ποντίκια συνέχισαν να λαμβάνουν ημερήσια δόση 30 mg/kg για τις επόμενες 7 μετεγχειρητικές ημέρες. Στις ομάδες ελέγχου χορηγήθηκε καθημερινά φυσιολογικός ορός. Τις μετεγχειρητικές ημέρες D1, D3, D5, και D7, μετρήθηκαν οι συγκεντρώσεις των IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-17A, TNF και ΙFΝ-γ στον ορό με κυτταρομετρία ροής. Την D7 μετά από ευθανασία των ζώων, πραγματοποιήθηκε ανάλυση με χορήγηση 68Ga-RGD. Ο γαστροκνήμιος μυς απομονώθηκε για ιστολογική αξιολόγηση. Βασικά ευρήματα: Παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική αύξηση (p <0,05) στις συγκεντρώσεις των IL-4, IL-10, IL-6 και IFN-γ στα ζώα άγριου τύπου που υποβλήθηκαν σε αγωγή με σιλοσταζόλη, ενώ η IL-2 φάνηκε να καταστέλλεται σε σημαντικό βαθμό. Στα ανοσοανεπαρκή ζώα που έλαβαν αγωγή, τα επίπεδα TNF, IL-6 και IFN-γ παρουσίασαν σημαντική αύξηση ενώ η πρόσληψη 68Ga-NODAGA-RGDfK και η έκφραση του υποδοχέα CD31 βρέθηκαν σημαντικά χαμηλότερες στο ισχαιμικό άκρο σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου. Παρατηρήθηκε σημαντική αύξηση στην έκφραση του υποδοχέα CD31 στα αγρίου τύπου ζώα που έλαβαν αγωγή, όχι όμως και στην πρόσληψη 68Ga-NODAGA-RGDfK σε σύγκριση με τα ζώα της ομάδας ελέγχου. Σημασία: Η σιλοσταζόλη φαίνεται να επηρεάζει σημαντικά τα ανοσοκύτταρα ως προς τις κυτταροκίνες που παράγουν μέσω μεταβολής του τύπου της ανοσολογικής απόκρισης, προάγοντας την παραγωγή αντιφλεγμονωδών κυτταροκινών στα άγριου τύπου ζώα και βοηθώντας τη βελτίωση της ανοσολογικής απόκρισης στα ζώα με ανοσοανεπάρκεια. Συμπεράσματα: Η σιλοσταζόλη φαίνεται να επηρεάζει σημαντικά τα ανοσοκύτταρα επιδρώντας κυρίως στην παραγωγή κυτταροκινών, τροποποιώντας έτσι τον τύπο της ανοσολογικής απόκρισης. Επιπλέον, η σιλοσταζόλη φαίνεται να προάγει την παραγωγή αντιφλεγμονωδών κυτταροκινών και να αναστέλλει την παραγωγή IL-2 στα άγριου τύπου ζώα, ενώ βοηθά στη βελτίωση των ανοσολογικών αποκρίσεων στα ανοσοανεπαρκή ζώα επάγοντας την έκκριση προφλεγμονωδών κυτταροκινών και IFN-γ, μια διαπίστωση που πρέπει να διερευνηθεί περαιτέρω. Όσον αφορά την επίδραση της σιλοσταζόλης στην αγγειογένεση, τα αποτελέσματά μας δείχνουν μειωμένη έκφραση του υποδοχέα της ιντεγκρίνης αvβ3 και του υποδοχέα CD31 στους ανοσοανεπαρκείς ποντικούς, ενώ παρατηρήθηκε σημαντική αύξηση στην έκφραση του υποδοχέα CD31 στα αγρίου τύπου ζώα που έλαβαν αγωγή, όχι όμως και στην πρόσληψη 68Ga-NODAGA-RGDfK σε σύγκριση με τα ζώα της ομάδας ελέγχου.