Μεταβολές της ποιότητας του σπέρματος του κάπρου κατά τη διάρκεια του έτους και προγνωστική αξία των εργαστηριακών διαγνωστικών δοκιμών για την in νίνο γονιμότητα

Abstract

The purpose of the present thesis was to study the characteristics of seminal parameters, and the expression of selected spermatozoa’s and seminal plasma proteins during a year and to identify their possible relationship to field fertility. Sixty-five (65) seminal samples were analyzed for the following parameters: viability, motility, kinetics, morphology, biochemical activity and functional ability of sperm membranes (HOST test), sperm mitochondrial potential and chromatin integrity. The evaluated seminal samples were collected from 18 boars, on a weekly basis for a whole year, while 468 sows were inseminated. The second experimental part determined the concentration of selected proteins of both sperm and seminal plasma. The third part of the thesis concerned the selection of the appropriate statistical analysis models, regarding the correlation of proteins’ concentration and sperm parameters with field fertility, as well as the investigation of possible seasonal changes in their values. Moreover, the impact of multiple sperm quality and protein parameters’ effects on swine AI’s outcome was studied. The first part of the experiments revealed that the percentage of immotile spermatozoa explains 6.7% (p = 0.04) of the variation of live born piglets and 6.5% (p = 0.04) of the variation of births with ≥12 piglets. The percentage of HOST-positive spermatozoa interprets 24.5% (p = 0.0001) of the live born piglets and 7.8% of the farrowings with ≥12 piglets. The variation of live born piglets can also be explained by the percentage of activated mitochondria (p = 0.01) by 13.5%. Finally, head morphological abnormalities can explain the variation of live born piglets by 8.9% (p= 0.02). Based on the data obtained from the second part of the experiments, there is a strong relation of seminal plasma osteopontin (OPN) with births with ≥12 piglets. Particularly, OPN70 and OPN12 explain the variation of births with ≥12 piglets by 6.5% (p = 0.04), and 8.8% (p = 0.02), respectively. In addition, the GPX5 sperm protein explains 6.7% (p = 0.04) of the farrowing rate. In terms of the seasonal variation of the examined parameters, significantly higher values of VSL, LIN (p = 0.04 and p = 0.03, respectively) and a lower percentage of sperm neck abnormalities (p = 0.01), where found in cold (October to June) compared to the warm (July to September) season. Concerning the proteins, a strong trend was observed with higher values of HSP90 and GPX5 in warm compared to the cold season (p = 0.07 and p = 0.06, respectively). In conclusion a) HOST is the most reliable assay for interpreting the variation of live born piglets; b) the variation of births with ≥12 piglets can be explained by the percentage of immotile sperm, the percentage of spermatozoa with active mitochondria and the concentration of OPN70 and OPN12; c) the GPX5 enzyme explains to a mean level the farrowing rate; d) the warm period negatively affects VSL and LIN, while the concentrations and hence the protective activity of GPX5 and HSP90 proteins increased significantly over the same period.

Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η μελέτη μιας σειράς παραμέτρων του σπέρματος, καθώς και επιλεγμένων πρωτεϊνών των σπερματοζωαρίων και του σπερματικού πλάσματος κατά τη διάρκεια ενός έτους, ώστε να εντοπισθούν οι πιθανές σχέσεις των μεταβολών αυτών με παραμέτρους γονιμότητας σε συνθήκες πράξης. Το πρώτο σκέλος της διατριβής είχε ως βασικό σκοπό την ανάλυση 65 δειγμάτων σπέρματος κάπρου ως προς τις παραμέτρους: ζωτικότητα, κινητικότητα, επί μέρους μορφές κίνησης, μορφολογία, βιοχημική δραστηριότητα-λειτουργική ικανότητα των μεμβρανών των σπερματοζωαρίων (δοκιμή HOST), λειτουργικότητα των μιτοχονδρίων και ακεραιότητα της χρωματίνης του πυρήνα των σπερματοζωαρίων. Τα δείγματα σπέρματος συλλέχθηκαν, σε εβδομαδιαία βάση, στη διάρκεια του έτους από 18 σπερματοδότες κάπρους. Τα εκσπερματίσματα χρησιμοποιήθηκαν για τη σπερματέγχυση 468 συών της ίδιας εκτροφής. Στο δεύτερο σκέλος προσδιορίστηκε η συγκέντρωση επιλεγμένων πρωτεϊνών τόσο των σπερματοζωαρίων όσο και του σπερματικού πλάσματος. Αρχικά, διαπιστώθηκε ότι κάποιες από τις παραμέτρους του σπέρματος που εξετάστηκαν σχετίζονταν σημαντικά με ορισμένους από τους δείκτες γονιμότητας. Το ποσοστό των ακίνητων σπερματοζωαρίων επηρέασε σημαντικά (p=0,04) τον αριθμό των ζωντανών γεννηθέντων χοιριδίων, εξηγώντας κατά 6,7% τη μεταβλητότητά τους, αλλά και τους τοκετούς με τοκετοομάδες ≥12 χοιριδίων (r2=0,065, p=0,04). Παράλληλα, και το ποσοστό των σπερματοζωαρίων με μορφολογικές ανωμαλίες της κεφαλής επηρέασε ακόμη περισσότερο (p=0,02) τον αριθμό των ζωντανών γεννηθέντων χοιριδίων, εξηγώντας κατά 8,9% τη διακύμανσή τους. Από την άλλη πλευρά το ποσοστό των σπερματοζωαρίων που ανταποκρίνονταν θετικά στη δοκιμή HOST επηρέασε πολύ σημαντικά (p=0,0001) τις παραπάνω παραμέτρους γονιμότητας εξηγώντας κατά 24,5% τη μεταβλητότητα του αριθμού των ζωντανών γεννηθέντων χοιριδίων και κατά 7,8% τη μεταβλητότητα των τοκετών με ≥12 χοιρίδια. Ομοίως και το ποσοστό των σπερματοζωαρίων με δραστηριοποιημένα μιτοχόνδρια επηρέασε πολύ σημαντικά (p=0,01) τον αριθμό των ζωντανών γεννηθέντων χοιριδίων εξηγώντας αντίστοιχα κατά 13,5% τη μεταβλητότητά τους. Αναφορικά με τις πρωτεΐνες προέκυψε τόσο η πρωτεΐνη του σπερματικού πλάσματος οστεοποντίνη OPN70, όσο και η OPN12 επηρέασαν σημαντικά (p=0,04 και p=0,02, αντίστοιχα) τον αριθμό των τοκετών με τοκετοομάδες ≥12 χοιριδίων, εξηγώντας αντίστοιχα κατά 6,5% και 8,8% τη μεταβλητότητά τους. Επιπρόσθετα, η πρωτεΐνη GPX5 των σπερματοζωαρίων επηρέασε σημαντικά (p=0,04) το ποσοστό των τοκετών εξηγώντας κατά 6,7% τη μεταβλητότητά του. Μεταξύ των εκσπερματισμάτων που συλλέχθηκαν στη διάρκεια της «ψυχρής» και της «θερμής» περιόδου, διαπιστώθηκαν σημαντικά μεγαλύτερες τιμές των παραμέτρων κινητικότητας των σπερματοζωαρίων VSL και LIN (p=0,04 και p=0,03, αντίστοιχα), καθώς και σημαντικά μικρότερο ποσοστό ανωμαλιών του αυχένα των σπερματοζωαρίων (p=0,01), την ψυχρή συγκριτικά με τη θερμή περίοδο. Αντίθετα, τη θερμή περίοδο προέκυψε ισχυρή τάση αύξησης των πρωτεϊνών HSP90 και GPX5 σε σύγκριση με την ψυχρή (p=0,07 και p=0,06, αντίστοιχα). Προέκυψαν τα ακόλουθα συμπεράσματα: α) η δοκιμή HOST μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ερμηνεία της μεταβλητότητας των ζωντανών γεννηθέντων χοιριδίων, β) τα ποσοστά των ακίνητων σπερματοζωαρίων και των σπερματοζωαρίων με ενεργοποιημένα μιτοχόνδρια καθώς και οι συγκεντρώσεις των πρωτεϊνών OPN70 και OPN12 στο σπερματικό πλάσμα, μπορούν να χρησιμοποιηθούν για την ερμηνεία της μεταβλητότητας των τοκετών με ≥12 χοιρίδια, γ) η GPX5 εξηγεί ως έναν βαθμό τη μεταβλητότητα του ποσοστού των τοκετών, δ) η θερμή περίοδος επηρεάζει περισσότερο αρνητικά τις παραμέτρους κινητικότητας των σπερματοζωαρίων VSL και LIN, ενώ οι συγκεντρώσεις των πρωτεϊνών GPX5 και HSP90 αυξάνονται στην ίδια περίοδο.