Επίδραση της ασταξανθίνης στη γονιμοποιητική ικανότητα του νωπού και του κρυοσυντηρημένου σπέρματος του κάπρου

Abstract

The aim of the study was to examine the effect of astaxanthin on extended and cryopreserved boar semen. The experiment of the study consists of two parts, the experiment A and B. In experiment A, the effect of astaxanthin on extended boar semen was examined. Twenty ejaculates (10 boars; 2ejaculates/boar) were extended in BTS and split in 3 groups: Control (C; no treatment), Solvent (S; semen with DMSO, the diluent of ASX), and Astaxanthin (ASX; semen with ASX at 0.5μΜ). Semen parameters [motility and kinetics evaluated by a CASA system, morphology, viability, functional integrity of sperm plasma membrane by Hypo-Osmotic Swelling Test (HOST), and DNA integrity] were assessed at 0, 24 and 48h of storage at 17o C (trial I), before (0h) and after (1h) sperm thermal resistance assay at 37o C (trial II), and finally before (0h) and after (1h) sperm incubation under in vitro conditions [38,5o C, 5% CO2, maximum humidity (trial III)]. The aim of the experiment B was to test whether overnight preincubation at 17o C of boar semen with astaxanthin prior to freezing (trial I) or overnight preincubation at 17o C of boar semen with astaxanthin prior to freezing, extended of boar semen with cooling extender supplemented with astaxanthin, and ASX supplementation on thawing (trial II) or astaxanthin supplementation only on thawing (trial III) may exert any protective effect against injury related to freezing and thawing. Totally, twenty eight entire ejaculates (4 boars; 7ejaculates/boar) were collected, pooled (4 boars; 1ejaculate/boar), extended in BTS (1:1; v:v) and split in 5 groups for cryopreservation procedure: control (C; no treatment), solvent control (S; semen with DMSO, the diluent of ASX), low astaxanthin (ASX 1; semen with ASX at 0,5μΜ), medium astaxanthin (ASX 2; semen with ASX at 5 μΜ) and high astaxanthin (ASX 3; semen with ASX at 15μΜ). Sperm quality and functionality parameters [motility (CASA) and viability/acrosome integrity, ROS production, lipid peroxidation, apoptosis (flow cytometer analysis)] were evaluated prior to freezing and after thawing (30 and 150 min). The results of the experiment A indicate the positive influence of astaxanthin on boar sperm parameters under storage conditions (17o C), after thermal resistance assay (37o C) and during incubation under in vitro conditions. Also, a mild beneficial effect of ASX on cryopreserved boar semen was observed after its addition on thawing. Further studies regarding in vivo and in vitro fertility should be performed to corroborate the beneficial effect of astaxanthin on boar semen.

Σκοπός της διδακτορικής διατριβής ήταν η μελέτη της επίδρασης της φυσικής προέλευσης ασταξανθίνης στο αραιωμένο και κρυοσυντηρημένο σπέρμα του κάπρου. Το πείραμα της παρούσας έρευνας αποτελείται από το δύο πειραματισμούς. Στον πρώτο πειραματισμό μελετήθηκε η επίδραση της προσθήκης ασταξανθίνης στο αραιωμένο σπέρμα του κάπρου υπό συνθήκες συντήρησης σε θερμοκρασία 17ο C για 48 ώρες (δοκιμή Ι), θερμικής καταπόνησης σε θερμοκρασία 37ο C για 1 ώρα (δοκιμή ΙΙ) και επώασης υπό in vitro συνθήκες (38,5ο C, 5% CO2, μέγιστη υγρασία) για 1 ώρα (δοκιμή ΙΙΙ). Συνολικά μελετήθηκαν 20 εκσπερματίσματα (10 κάπροι, 2 εκσπερματίσματα/κάπρο) τα οποία αραιώθηκαν σε BTS και χωρίστηκαν στις ακόλουθες ομάδες: μάρτυρας σπέρματος (Σ), μάρτυρας διαλύτη (αραιωμένο σπέρμα με την προσθήκη DMSO, Δ) και ασταξανθίνη (αραιωμένο σπέρμα με την προσθήκη διαλύματος ασταξανθίνης σε συγκέντρωση 0,5μΜ, ΑΣΤ). Οι παράμετροι του σπέρματος [κινητικότητα και επιμέρους μορφές κίνησης (CASA), μορφολογία, ζωτικότητα, λειτουργική ακεραιότητα της κυτταροπλασματικής μεμβράνης με την εφαρμογή της βιοχημικής δοκιμής αντοχής έναντι της καταπόνησης σε υπό ωσμωτικό διάλυμα (δοκιμή HOST), ακεραιότητα της χρωματίνης του πυρηνικού γενετικού υλικού] εκτιμήθηκαν 0, 24, 48 ώρες υπό συνθήκες συντήρησης σε θερμοκρασία 17ο C, πριν (0 ώρα) και μετά (1 ώρα) την εφαρμογή θερμικής καταπόνησης στους 37ο C και τέλος πριν (0 ώρα) και μετά (1 ώρα) την επώαση του σπέρματος υπό in vitro συνθήκες (38,5ο C, 5% CO2, μέγιστη υγρασία). Στον δεύτερο πειραματισμό της έρευνας μελετήθηκε η επίδραση της ασταξανθίνης στο κρυοσυντηρημένο/αναθερμασμένο σπέρμα του κάπρου με την προσθήκη διαλύματος του αντιοξειδωτικού στο στάδιο της ολονύκτιας επώασης σε θερμοκρασία 17ο C (δοκιμή Ι) ή στο στάδιο της ολονύκτιας επώασης σε θερμοκρασία 17ο C, της αραίωσης με το αραιωτικό ψύξης (17ο C) και της αναθέρμανσης σε θερμοκρασία 37ο C (δοκιμή ΙΙ) ή μόνο στο στάδιο της αναθέρμανσης (δοκιμή ΙΙΙ). Συνολικά μελετήθηκαν 28 εκσπερματίσματα (4 κάπροι, 7 εκσπερματίσματα/κάπρο), τα οποία αραιώνονταν σε BTS (1:1), αναμιγνύονταν (4 εκσπερματίσματα, 1 εκσπερμάτισμα/κάπρο) και διαχωρίζονταν στις ακόλουθες ομάδες: μάρτυρας σπέρματος (αναμεμιγμένο αραιωμένο σπέρμα, Σ), μάρτυρας διαλύτη (αναμεμιγμένο αραιωμένο σπέρμα με την προσθήκη DMSO, Δ), ασταξανθίνη χαμηλής συγκέντρωσης (αναμεμιγμένο αραιωμένο σπέρμα με την προσθήκη διαλύματος ασταξανθίνης 0,5μΜ, ΑΣΤ 1), ασταξανθίνη μέσης συγκέντρωσης (αναμεμιγμένο αραιωμένο σπέρμα με την προσθήκη διαλύματος ασταξανθίνης 5μΜ, ΑΣΤ 2) και ασταξανθίνη υψηλής συγκέντρωσης (αναμεμιγμένο αραιωμένο σπέρμα με την προσθήκη διαλύματος ασταξανθίνης 15μΜ, ΑΣΤ 3). Οι παράμετροι του σπέρματος [κινητικότητα (CASA) και ζωτικότητα/ακεραιότητα της ακροσωμιακής μεμβράνης, ενδοκυτταρικός σχηματισμός ROS, λιπιδική υπεροξείδωση της κυτταροπλασματικής μεμβράνης, απόπτωση (ανάλυση σε κυτταρομετρητή ροής)] αξιολογήθηκαν πριν την κρυοσυντήρηση και σε δύο χρόνους μετά την αναθέρμανση (30 και 150 λεπτά). Σύμφωνα με τα αποτελέσματα των δύο πειραματισμών η προσθήκη διαλύματος ασταξανθίνης είχε θετική επίδραση στις παραμέτρους του αραιωμένου σπέρματος κατά τη συντήρηση σε θερμοκρασία 17ο C, τη θερμική καταπόνηση σε θερμοκρασία 37ο C και κατά την επώαση υπό in vitro συνθήκες. Επίσης, παρατηρήθηκε μία ήπια δράση της ασταξανθίνης στο κρυοσυντηρημένο/ αναθερμασμένο σπέρμα του κάπρου κατά την προσθήκη της μόνο στο στάδιο της αναθέρμανσης. Περαιτέρω μελέτες αναφορικά με την in vivo και in vitro γονιμότητα θα είχαν αξία να πραγματοποιηθούν ώστε να ενισχύσουν την ευεργετική επίδραση της ασταξανθίνης στο σπέρμα του κάπρου.