Ο ρόλος του υαλουρονικού οξέος στην ενεργοποίηση των κερατινοκυττάρων από αλλεργιογόνα επαφής

Abstract

Allergic contact dermatitis (ACD) is the most common dermatopathy and is caused by topical exposure to chemical allergens. ACD is a type IV (delayed) hypersensitivity response resulting in sterile inflammation. The term “sterile” characterizes inflammatory responses not caused by pathogens/ microbes. Importantly, almost 20% of the general population presents ACD to at least one or more contact allergens. The symptoms include erythema, vesiculation, scaling and itchiness. Contact allergens are haptens, low molecular weight chemicals (<1000Da) normally unable to trigger immune responses. Hence, binding of haptens to self- macromolecules is crucial for the initiation of inflammation. The complexity of the immune system may sometimes result in a “mistaken” response to haptens. P-phenylenediamine (PPD) and 2,4 dinitrochlorobenxene (DNCB) are common contact sensitizers, responsible for many cases of ACD. They were previously shown to trigger the production of IL-18, a reliable marker of keratinocyte sensitization. Epidermal keratinocytes play a key role in innate immunity, affect the skin inflammatory responses and are crucial for ACD progression. The extracellular matrix (ECM) that provides tissue structure, specificity and organization, regulates as well cellular functions and responses, such as inflammation by triggering specific signaling pathways. Hyaluronic acid or Hyaluronan (HA), an important ECM component, is a linear non-sulfated glycosaminoglycan, composed of repeating units of N-acetylglucosamine (GlcNAc) and glucuronic acid. HA is well established to participate in a wide variety of biological functions. The metabolism of HA has been demonstrated to play an important role in sterile inflammation. Indeed, HA deposition has been demonstrated to be altered, upon keratinocyte treatment with PPD and DNCB contact sensitizers. Notably, Low molecular weight Hyaluronan (LWMHA) is able to trigger IL-18 production. HA is synthesized by specific enzymes called Hyaluronan Synthases (HAS1, HAS2 and HA3). The process takes place on the plasma membrane where these enzymes are located, with simultaneous secretion of the HA chain to the ECM. HA degradation is performed by enzymes denominated, Hyaluronidases (HYAL1 and HYAL2). In the skin HA is synthesized mainly by dermal fibroblasts, but also by epidermal keratinocytes. Toll- like receptors (TLRs) are a family of transmembrane receptors, widely known for their roles in innate immunity. Toll-like receptor 4 (TLR4), is strongly implicated in skin inflammation with the ability to bind Damage Associated Molecular Patterns (DAMPs), including LMWHA. DAMPs are endogenous molecules, with the ability to act as “danger signals,” that trigger cellular responses and they have strongly been correlated to the process of sterile inflammation. A category of DAMPs are the Reactive Oxygen Species (ROS), chemically active small molecules, resulting from incomplete reduction of oxygen. Indeed, ROS have been characterized as mediators of inflammation and noteworthy they can degrade HA chemically. TLR4 activation results in the downstream triggering of nuclear factor kappa-beta (NF-κΒ), the transcription factor, established to regulate the transcription of pro- inflammatory cytokines. In its inactive form this transcription factor is located to the cytoplasm, while in its activated form, translocates to the nucleus engaged in the transcription of several genes. NF-κΒ has been strongly correlated to innate immunity and inflammation. In fact, several therapeutic approaches for inflammation target the inhibition of TLR4/ NF-κΒ signaling. In the present study, the putative co- operation of HA and TLR4 in the process of contact allergen- induced keratinocyte activation was investigated. Specifically, contact sensitizers PPD and DNCB were shown, in NCTC2544 human keratinocytes, to significantly increase the expression of the TLR4 receptor in a concentration dependant manner, as demonstrated by western blot and Real-time PCR. The contact allergens were also demonstrated to induce HAS1, HAS2 and HAS3 overexpression at both the protein and mRNA level. These data suggest that the contact sensitizers enhance HMWHA production by the upregulation of HAS isoforms. Thus, the previously shown contact sensitizer mediated HYALs upregulation in combination to ROS action, will increase endogenous LMWHA release. Furthermore, LMWHA treatment of keratinocytes induced increased expression of not only the TLR4 receptor, but also of the HAS1 and HAS3 enzymes. This observation implies that the increased release of LMWHA by the activated keratinocytes will result in enhanced HMWHA deposition, available for degradation to LMWHA and the subsequent TLR4 signaling, forming a loop for the sustaining of inflammation. Moreover, downregulation of TLR4, upon RNA interference utilization, resulted in an attenuation of HAS1 and HAS3 basal levels, suggesting a direct correlation between HA synthesis and TLR4 signaling. PPD and DNCB effects on HA metabolism, were shown to be partly executed through the TLR4 downstream signaling. Indeed, blocking of the TLR4 receptor with a neutralizing antibody, resulted in attenuated contact allergen mediated HYAL and HAS upregulation. Furthermore, PPD and DNCB stimulated the activation of the TLR4 downstream mediator NF-κB as well as its translocation to the nuclei of keratinocytes. Blocking of TLR4 activities reduced NF-κΒ activation. Additionally, LMWHA treatment enhanced NF-κB activation, whereas blocking HYALs’ action with an inhibitor (aristolochic acid) attenuated the contact allergen mediated NF-κΒ activation. In conclusion, keratinocyte sensitization by the PPD and DNCB contact allergens is partly mediated via a LMWHA/ TLR4/ NF-κB signaling axis.

Η αλλεργική δερματίτιδα εξ επαφής (ACD) είναι η πιο συχνή δερματοπάθεια και προκαλείται από την επαφή του δέρματος με χημικά αλλεργιογόνα. Αποτελεί μία αντίδραση υπερευαισθησίας τύπου IV (επιβραδυνόμενη), της οποίας το αποτέλεσμα είναι η «στείρα» φλεγμονή. Ο όρος «στείρα» αντιπροσωπεύει φλεγμονώδεις αποκρίσεις που δεν προκαλούνται από παθογόνα/ μικρόβια. Σχεδόν το 20% του γενικού πληθυσμού παρουσιάζει αλλεργική δερματίτιδα σε τουλάχιστον ένα αλλεργιογόνο, ή ακόμη και σε περισσότερα. Στα συμπτώματα συγκαταλέγονται ερυθρότητα, φυσαλιδώδες δέρμα, απολέπιση και κνησμός. Τα αλλεργιογόνα που προκαλούν δερματίτιδα εξ επαφής αποτελούν απτένια, δηλαδή ατελή αντιγόνα που είναι χημικά χαμηλού μοριακού βάρους (<1000Da) τα οποία υπό φυσιολογικές συνθήκες αδυνατούν να προκαλέσουν ανοσολογικές αποκρίσεις (ατελή αντιγόνα). Επομένως, για να πυροδοτηθεί η διαδικασία της φλεγμονής, είναι απαραίτητη η πρόσδεση των απτενίων με μακρομόρια του εαυτού. Η πολυπλοκότητα του ανοσοποιητικού συστήματος είναι πολύ πιθανό να οδηγήσει σε «λανθασμένες» αποκρίσεις στα απτένια. Δύο συνηθισμένα αλλεργιογόνα υπεύθυνα για πολλές περιπτώσεις δερματίτιδας εξ επαφής είναι η παραφενυλενεδιαμίνη (PPD) και το 2,4 δινιτροχλωροβενζένιο (DNCB). Σε προηγούμενες μελέτες έχει δειχθεί η ιδιότητά τους να προκαλούν στα κερατινοκύτταρα την παραγωγή ιντερλευκίνης- 18 (IL-18), η οποία αποτελεί αποδεκτό δείκτη για το χαρακτηρισμό ουσιών που προκαλούν «υπερευαισθησία εξ επαφής». Τα κερατινοκύτταρα της επιδερμίδας διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στην έμφυτη ανοσία, επηρεάζουν φλεγμονώδεις αποκρίσεις, επομένως, είναι εξαιρετικής σημασίας για την εξέλιξη της αλλεργικής δερματίτιδας εξ επαφής. Η εξωκυττάρια θεμέλια ουσία (ECM) η οποία καθορίζει στους ιστούς τη δομή τους, την ιστοειδικότητα και την οργάνωση, ρυθμίζει πολλές κυτταρικές λειτουργίες και αποκρίσεις, για παράδειγμα πρόκληση φλεγμονής, καθώς πυροδοτεί την ενεργοποίηση συγκεκριμένων σηματοδοτικών μονοπατιών. Ένα ιδιαίτερα σημαντικό συστατικό της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας είναι το υαλουρονικό οξύ, δηλαδή μία γραμμική μη θειωμένη γλυκοζαμινογλυκάνη. Συντίθεται από επαναλαμβανόμενες μονάδες N-ακετυλ-γλυκοζαμίνης (GlcNAc) και γλυκουρονικού οξέος. Το υαλουρονικό οξύ είναι γνωστό για την πληθώρα των βιολογικών λειτουργιών που επηρεάζει και μάλιστα, συχνά αυτές οι λειτουργίες είναι αντίθετες μεταξύ τους, καθώς εξαρτώνται από το μοριακό βάρος του υαλουρονικού. Ο μεταβολισμός του υαλουρονικού οξέος διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στη στείρα φλεγμονή. Επιπρόσθετα, η επώαση κερατινοκυτταρων με τα αλλεργιογόνα PPD και DNCB είναι υπεύθυνη για αλλαγές στην τοποθέτηση του υαλουρονικού. Επιπλέον, το χαμηλού μοριακού βάρους υαλουρονικό (LWMHA) προκαλεί παραγωγή ιντερλευκίνης- 18. Η σύνθεση του υαλουρονικού οξέος γίνεται από κατάλληλα ένζυμα που ονομάζονται συνθάσες του υαλουρονικού (HAS1, HAS2 and HA3). Η σύνθεση πραγματοποιείται στην κυτταρική μεμβράνη όπου εδράζονται τα συγκεκριμένα ένζυμα, με ταυτόχρονη έκκριση του μακρομορίου στην εξωκυττάρια θεμέλια ουσία. Η αποικοδόμησή του γίνεται από μία άλλη κατηγορία ενζύμων τις υαλουρονιδάσες (HYAL1 και HYAL2). Η σύνθεση του υαλουρονικού στο δέρμα γίνεται κυρίως από τους ινοβλάστες της δερμίδας, αλλά και από τα κερατινοκύτταρα της επιδερμίδας. Οι Toll- like υποδοχείς (TLRs) αποτελούν μία οικογένεια διαμεμβρανικών υποδοχέων, ευρέως γνωστών για τους πολλαπλούς ρόλους τους στην έμφυτη ανοσία. Μεταξύ των μελών αυτής της κατηγορίας υποδοχέων, ιδιαίτερη σημασία έχει ο TLR4, ο οποίος έχει συσχετιστεί με τους μηχανισμούς φλεγμονής του δέρματος. Χαρακτηριστικό του είναι η ιδιότητά του να προσδένει μοριακά μοτίβα που σχετίζονται με βλάβες (DAMPs), όπως είναι το χαμηλού μοριακού βάρους υαλουρονικό οξύ. Τα DAMPs είναι ενδογενή μόρια που δρουν ως «σήματα κινδύνου» και πυροδοτούν διάφορες κυτταρικές λειτουργίες και μάλιστα έχουν συσχετιστεί με ασθένειες στείρας φλεγμονής. Μία συγκεκριμένη κατηγορία DAMPs είναι μικρά χημικά ενεργά μόρια που προκύπτουν από ατελή αναγωγή του οξυγόνου και ονομάζονται δραστικές μορφές οξυγόνου (ROS). Μάλιστα, έχουν χαρακτηριστεί ως ρυθμιστές της φλεγμονής και έχουν την ικανότητα να αποικοδομούν χημικά το υαλουρονικό οξύ. Η ενεργοποίηση του υποδοχέα TLR4, έχει ως συνέπεια την ενεργοποίηση ενός μεταγραφικού παράγοντα που ονομάζεται Πυρηνικός παράγοντας- κάππα βήτα (NF-κΒ), και είναι γνωστός για τη μεταγραφή προ- φλεγμονωδών κυτοκινών. Η ανενεργή μορφή του απαντάται στο κυτταρόπλασμα, ενώ στον πυρήνα βρίσκεται σε ενεργοποιημένη μορφή, επάγοντας μεταγραφή πολλών γονιδίων. Ο NF-κΒ έχει συσχετιστεί με μηχανισμούς έμφυτης ανοσίας και φλεγμονής. Μάλιστα, ορισμένες θεραπευτικές προσεγγίσεις κατά της φλεγμονής, στοχεύουν την αναστολή της σηματοδότησης TLR4/ NF-κΒ. Στην παρούσα διατριβή μελετήθηκε η πιθανή συνεργασία του υαλουρονικού οξέος με τον υποδοχέα TLR4 στη διαδικασία ενεργοποίησης των κερατινοκυττάρων από αλλεργιογόνα επαφής. Πιο συγκεκριμένα, τα αλλεργιογόνα PPD και DNCB προκάλεσαν σημαντική αύξηση του υποδοχέα TLR4 με τρόπο εξαρτώμενο από τη συγκέντρωσή τους, στην κυτταρική σειρά ανθρώπινων κερατινοκυττάρων NCTC2544, όπως φάνηκε με τις τεχνικές της ανοσοαποτύπωσης κατά western και της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης πραγματικού χρόνου (Real- time PCR). Επιπλέον, τα αλλεργιογόνα οδήγησαν σε αυξημένη έκφραση των συνθασών του υαλουρονικού HAS1, HAS2 and HAS3, επίσης σε επίπεδο πρωτεΐνης και mRNA. Τα δεδομένα αυτά υποδεικνύουν ότι τα αλλεργιογόνα εξ επαφής επάγουν αύξηση της σύνθεσης του υψηλού μοριακού βάρους υαλουρονικού από τις αυξημένες συνθάσες του. Επιπλέον, η επαγόμενη από αλλεργιογόνα αύξηση των υαλουρονιδασών σε συνδυασμό με τη δράση των δραστικών μορφών οξυγόνου, οδηγεί στην αύξηση των ενδογενών επιπέδων του χαμηλού μοριακού βάρους υαλουρονικού. Επιπρόσθετα, η επώαση των κερατινοκυττάρων με υαλουρονικό οξύ χαμηλού μοριακού βάρους, προκάλεσε αύξηση της έκφρασης του υποδοχέα TLR4, όπως επίσης και των συνθασών HAS1 και HAS3. Αυτό καταδεικνύει πως η αύξηση του χαμηλού μοριακού βάρους υαλουρονικό στα ενεργοποιημένα κερατινοκύτταρα, θα οδηγήσει σε επιπλέον υψηλού μοριακού βάρους υαλουρονικό, διαθέσιμο για αποικοδόμηση σε μικρότερα τμήματα και περεταίρω ενεργοποίηση της σηματοδότησης του TLR4, σαν μία «λούπα» διατήρησης της φλεγμονής. Ακόμα, σε συνθήκες έλλειψης TLR4, με τη μέθοδο RNA σίγησης, μειώθηκαν τα ενδογενή επίπεδα των συνθασών HAS1 και HAS3, δείχνοντας μία άμεση συσχέτιση μεταξύ σύνθεσης του υαλουρονικού και της σηματοδότησης του TLR4. Οι επιπτώσεις των αλλεργιογόνων PPD and DNCB στο μεταβολισμό του υαλουρονικού οξέος, φάνηκε να εκτελούνται έστω μερικώς από τη σηματοδότηση του TLR4. Αυτό προέκυψε από το γεγονός ότι αναστολή του υποδοχέα TLR4 με ειδικό αντίσωμα, οδήγησε σε μείωση της επαγόμενης από αλλεργιογόνα αύξησης των υαλουρονιδασών και των συνθασών του υαλουρονικού. Ιδιαίτερα σημαντικό ήταν το γεγονός ότι τα αλλεργιογόνα PPD και DNCB επηρέασαν την ενεργοποίηση του NF-κB, όπως επίσης και τη μετατόπισή του στον πυρήνα. Αναστολή της δράσης του TLR4 προκάλεσε μείωση στην ενεργοποίηση του NF-κΒ. Επιπλέον, επώαση με χαμηλού μοριακού βάρους υαλουρονικό οξύ ενίσχυσε την ενεργοποίηση του NF-κΒ στα κερατινοκύτταρα. Η αναστολή της δράσης των υαλουρονιδασών με κατάλληλο αναστολέα (αριστολοχικό οξύ), είχε ως συνέπεια τη μείωση της επαγόμενης από αλλεργιογόνα ενεργοποίησης του NF-κΒ. Συμπερασματικά, η ενεργοποίηση των κερατινοκυττάρων καθορίζεται μερικώς από τον σηματοδοτικό άξονα χαμηλού μοριακού βάρους υαλουρονικό οξύ/ TLR4/ NF-κB.