Παρασκευή, απομόνωση, χαρακτηρισμός και αλληλεπίδραση με RNA της πρωτεΐνης La μέσω φασματοσκοπίας NMR

Abstract

La protein is located in the nucleus and was first described as an auto-antigen in patients suffering from rheumatic systemic lupus erythematosus and Sjögren syndrome. It was the first protein of the LARPs superfamily to be described. La plays an important role in the physiological function of the organism, because it forms ribonucleoprotein complexes with a variety of different RNA molecules. La has a key role in biogenesis of the RNAP III transcripts such as pre-tRNAs by protecting their UUU-3΄-OH end from exonucleases and in the adoption of the correct folding. La protein is conserved in various organisms and displays a common organization of its domains. The N-terminal domain consist of LaM and RRM1, while the C-terminal end varies in size and sequence. The C-terminal from human La and from Dictyostelium discoideum consist of an additional RRM motif, RRM2α, and a C-terminus unstructured region.This dissertation presents the design, the expression and the isolation of the individual domain and of the larger polypeptides, which are the combination of these domains from Dictyostelium discoideum and from human La protein in order to elucidate their structure and their function via NMR spectroscopy. The LaM domain adopts the classical structural elements of these motifs, while the RRM1 and RRM2a domains of La protein from Dictyostelium discoideum exhibit the classical structure of the RRM motifs with the addition of an α-helix in their C-terminal end of both RRMs. The NMR structural study of the RRM1-RRM2a polypeptide is performed by applying the segmental labeling technique because of the large size of the polypeptide. This technique is applied to large proteins consisting of distinct domains and makes it possible to label one domain of the protein in the presence of the other unlabeled domains. Moreover, we identify the binding sites of the individual domains and their combinations upon the addition of the pre-tRNAArg and a synthetic ten oligomeric oligonucleotide (polyU) by NMR study.

Η πρωτεΐνη La είναι μία πυρηνική πρωτεΐνη που περιγράφηκε για πρώτη φορά στον άνθρωπο ως αυτο-αντιγόνο σε ασθενείς που έπασχαν από Ερυθυματώδη Λύκο (Systemic Lupus Erythematosus) και σύνδρομο Sjögren. Αποτελεί την πρώτη πρωτεΐνη της υπεροικογένειας των LARP που περιγράφηκε. Διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στις φυσιολογικές λειτουργίες του οργανισμού, καθώς σχηματίζει ριβονουκλεοπρωτεϊνικά σύμπλοκα μεποικιλία διαφορετικών μορίων RNA. Βασικός ρόλος της πρωτεΐνης La είναι η προστασία του UUU-3΄-OH άκρου των μεταγράφων της RNAP III, όπως των pre-tRNA κατά τη διάρκεια της βιογένεσής τους και η σωστή αναδίπλωσή τους στο χώρο. Η πρωτεΐνη La είναι συντηρημένη σε διάφορους οργανισμούς και εμφανίζει κοινή οργάνωση των επικρατειών. Το Ν-τελικό άκρο αποτελείται από τις επικράτειες LaM και RRM1, ενώ το C-τελικό της άκρο ποικίλει σε μέγεθος και αλληλουχία. Το C-τελικό άκρο της ανθρώπινης πρωτεΐνης La και της πρωτεΐνης La του οργανισμού Dictyostelium discoideum περιλαμβάνει ένα δεύτερο μοτίβο RRM, το RRM2α και μια ευκίνητη περιοχή στο C-τελικό άκρο.Στην παρούσα διατριβή παρουσιάζεται ο σχεδιασμός, η έκφραση και η απομόνωση των επιμέρους επικρατειών και μεγαλύτερων πολυπεπτιδίων που περιλαμβάνουν τον συνδυασμό των επικρατειών αυτών της πρωτεΐνης La του Dictyostelium discoideum και της ανθρώπινης πρωτεΐνης La, ώστε να πραγματοποιηθεί η δομική και η λειτουργική τους μελέτη μέσω της Φασματοσκοπίας NMR. Η επικράτεια LaM εμφανίζει τα κλασικά δομικά στοιχεία των μοτίβων αυτών, ενώ οι επικράτειες RRM1 και RRM2α του Dictyostelium discoideum εμφανίζουν την κλασική δομή των μοτίβων RRM με την προσθήκη μίας έλικας στο C-τελικό και των δύο RRM. Η δομική μελέτη μέσω της Φασματοσκοπίας NMR του πολυπεπτιδίου RRM1-RRM2α πραγματοποιείται με εφαρμογή της τεχνικής της τμηματικής επισήμανσης, εξαιτίας του μεγάλου μεγέθους του πολυπεπτιδίου. Η τεχνική αυτή εφαρμόζεται σε μεγάλες πρωτεΐνες που αποτελούνται από διακριτές επικράτειες, καθώς είναι δυνατή η επισήμανση μίας επικράτειας της πρωτεΐνης παρουσία και των υπολοίπων μη-επισημασμένων επικρατειών. Ακολούθησε η χαρτογράφηση των περιοχών των επιμέρους επικρατειών και των συνδυασμών τους που υφίστανται αλλαγές μετά την προσθήκη του φυσιολογικού υποστρώματος (pre-tRNAArg) και ενός συνθετικού δεκαμερούς ολιγονουκλεοτιδίου αποτελούμενο από δέκα ουριδίλια (polyU).