Neuroprotective approaches in experimental models of retinal degeneration

Abstract

BNN27, a blood-brain barrier-permeable, C17-spiroepoxy derivative of dehydroepiandrosterone (DHEA) has shown promising neuroprotective activity through interaction with nerve growth factor receptors, tropomyosin receptor kinase A (TrkA) and pan-neurotrophin receptor p75NTR. In this study, we administered systemically BNN27 in two murine models of acute retinal degeneration/injury; experimental retinal detachment (RD) that results in photoreceptor cell death and N-methyl-D-aspartate (NMDA)-induced retinal excitotoxicity that results in cell death primarily of the inner retina and the retinal ganglion cells (RGCs). TUNEL+ (Terminal deoxynucleotidyl transferase -TdT- dUTP Nick-End Labeling) photoreceptors were significantly decreased 24 hours post RD after a single administration of 200 mg/kg BNN27. Furthermore, BNN27 increased inflammatory cell infiltration, as well as, two markers of gliosis 24 hours post RD. However, single or multiple doses of BNN27 were not able to protect the overall survival of photoreceptors 7 days post injury. Additionally, BNN27 did not induce the activation/phosphorylation of TrkAY490 in the detached retina although the mRNA levels of the receptor were increased in the detached photoreceptors. In NMDA-mediated retinal injury, BNN27 was able to reduce TUNEL+ cell death only in the photoreceptors and not in the RGCs or the inner retina in any of the three doses that we tested. Furthermore, it did not induce any changes in macrophage/microglia cell infiltration or in NMDA-mediated retinal gliosis. Moreover, similarly to RD injury, BNN27 did not induce the activation/phosphorylation of TrkAY490 in the NMDA-mediated injured retina although TrkA was downregulated following NMDA insult. Together, these findings, do not demonstrate neuroprotective activity of BNN27 in experimentally-induced RD or NMDA-mediated retinal excitotoxicity. Further studies are needed in order to elucidate the paradox/contradiction of these results and the mechanism of action of BNN27 in these models of acute retinal cell damage.

Το BNN27, [(R)-3β, 21-dihydroxy-17R, 20-epoxy-5-pregnene] είναι ένα συνθετικό ανάλογο της δεϋδροεπιανδροστερόνης (dehydroepiandrosterone, DHEA), το οποίο έχει δείξει σημαντική αντί-αποπτωτική δράση (είδος κυτταρικού θανάτου) σε καλλιέργειες πρωτογενών νευρώνων, μέσω της πρόσδεσης του στους υποδοχείς της νευροτροφίνης nerve growth factor (NGF), tropomyosin kinase receptor A (TrkA) και pan-neurotrophin receptor p75NTR. Το καινοτόμο αυτό στεροειδές είναι ένα μικρό, λιπόφιλο μόριο, το οποίο διαπερνάει τον αιματοεγκεφαλικό φραγμό και κατ’ επέκταση μπορεί να χορηγηθεί συστηματικά. Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η συστηματική χορήγηση του μορίου ΒΝΝ27 σε δύο διαφορετικά πειραματικά μοντέλα οξείας νευροεκφύλισης του αμφιβληστροειδή σε τρωκτικά (επίμυες). Το πρώτο προκλινικό μοντέλο το οποίο εξετάστηκε, και στο οποίο δόθηκε και η μεγαλύτερη βαρύτητα, ήταν η πειραματική αποκόλληση του αμφιβληστροειδή, η οποία οδηγεί στον κυτταρικό θάνατο του έξω αμφιβληστροειδή λόγω της απομάκρυνσης των φωτοϋποδοχέων (φωτοαισθητήρια κύτταρα του οφθαλμού) από το μελάγχρουν επιθήλιο και τα χοριοτριχοειδή, τα οποία είναι η μοναδική πηγή μεταβολισμού τους. Το δεύτερο μοντέλο το οποίο εξετάστηκε ήταν αυτό της N-Methyl-D-aspartate (NMDA) διεγερσιτοξικότητας, το οποίο έχει ως αποτέλεσμα τον κυτταρικό θάνατο, πρωτίστως, του έσω αμφιβληστροειδή και συγκεκριμένα των γαγγλιακών κυττάρων (τα κύτταρα των οποίων οι άξονες σχηματίζουν το οπτικό νεύρο) και κάποιων υποτύπων αμακρυνικών κυττάρων (ενδιάμεσοι νευρώνες του αμφιβληστροειδή).Τα αποτελέσματα της μελέτης μας έδειξαν ότι μία χορήγηση ΒΝΝ27 (200 mg/kg) μία ώρα μετά την επαγωγή της πειραματικής αποκόλλησης, μειώνει σημαντικά τον κυτταρικό θάνατο των TUNEL+ (Terminal deoxynucleotidyl transferase -TdT- dUTP Nick-End Labeling) φωτοϋποδοχέων 24 ώρες αργότερα. Επίσης, το ίδιο σχήμα χορήγησης, αύξησε σημαντικά τον αριθμό των CD11b+ φλεγμονωδών κυττάρων στον υπαμφιβληστροειδικό χώρο και στον αμφιβληστροειδή στις 24 ώρες μετά την αποκόλληση. Συγκεκριμένα, όχι μόνο αυξήθηκε ο αριθμός των κυττάρων τα οποία εξέφραζαν τον κυτταρικό δείκτη CD11b (μακροφάγα και μικρογλοία), αλλά παρατηρήθηκε και αυξημένος αριθμός συσσωματωμάτων κυττάρων φλεγμονής στον υπαμφιβληστροειδικό χώρο. Παρομοίως, υπήρξε αυξημένη έκφραση σε δύο δείκτες γλοίωσης (GFAP και vimentin) στις 24 ώρες στην ομάδα των πειραματόζωων που είχαν λάβει μία χορήγηση ΒΝΝ27 (200 mg/kg). Στη συνέχεια, οι μελέτες για την έκφραση των υποδοχέων έδειξαν ότι ο TrkA δεν εκφράζεται σε υγιείς φωτοϋποδοχείς ενώ αυξάνεται δραστικά η έκφραση του 24 ώρες μετά την αποκόλληση, σε αντίθεση με τον υποδοχέα p75NTR όπου η έκφραση του παρέμεινε σταθερή πριν και μετά τον τραυματισμό. Σχετικά με τη φωσφορυλίωση του υποδοχέα (phospho-TrkA), δεν παρατηρήθηκε κάποια σημαντική διαφορά ανάμεσα στους αποκολλημένους αμφιβληστροειδείς της ομάδας ελέγχου και της ομάδας που της είχε χορηγηθεί BNN27 (200 mg/kg), όπως δεν παρατηρήθηκε και καμία διαφορά στα επίπεδα φωσφορυλίωσης των πρωτεϊνών (Akt και ERK1/2) οι οποίες βρίσκονται downstream του TrkA υποδοχέα και επάγουν νευροπροστατευτική σηματοδότηση. Τέλος, διερευνήθηκε η μακροχρόνια πιθανή νευροπροστασία μέσω του ΒΝΝ27; Mία χορήγηση 200 mg/kg δεν μείωσε σημαντικά τον TUNEL+-κυτταρικό θάνατο αλλά ούτε ήταν αρκετή για να αλλάξει σημαντικά το πάχος της στιβάδας των φωτοϋποδοχέων 7 ημέρες μετά την αποκόλληση. Παρομοίως, 7 επαναλαμβανόμενες χορηγήσεις της ίδιας δόσης (200 mg/kg) δεν επέφεραν νευροπροστασία στον αμφιβληστροειδή. Επιπροσθέτως, έγινε διερεύνηση με τρεις ακόμα δόσεις (10, 50 και 100 mg/kg) με 7 επαναλαμβανόμενες χορηγήσεις αλλά ούτε αυτές οι προσεγγίσεις έφεραν κάποια σημαντική αλλαγή στη διατήρηση του πάχους του αμφιβληστροειδή. Στη συνέχεια, διερευνήσαμε την πιθανή νευροπροστατευτική δράση του BNN27 στο μοντέλο της NMDA διεγερσιτοξικότητας. Mία ενδοϋαλοειδική ένεση 100 nmoles NMDA είχε ως αποτέλεσμα τον οξύ και μαζικό θάνατο των κυττάρων του αμφιβληστροειδή σε όλες του τις στιβάδες 24 ώρες αργότερα. Μία χορήγηση ΒΝΝ27 σε τρεις διαφορετικές δόσεις (40, 100 και 200 mg/kg), μία ώρα μετά την ενδοϋαλοειδική ένεση, δεν κατάφερε να μειώσει (καμία από τις τρεις δόσεις) τον TUNEL+-κυτταρικό θάνατο των γαγγλιακών κυττάρων και των αμακρυνικών κυττάρων του έσω αμφιβληστροειδή, αλλά μείωσε σημαντικά (και οι τρεις δόσεις) τον TUNEL+-κυτταρικό θάνατο των φωτοϋποδοχέων. Σε αυτό το μοντέλο δεν καταφέραμε να δούμε καμία διαφορά στη διήθηση των CD11b+ φλεγμονωδών κυττάρων, στη γλοίωση του αμφιβληστροειδή (GFAP και vimentin) και στη φωσφορυλίωση του TrkA υποδοχέα ανάμεσα στην ομάδα των πειραματόζωων που είχαν λάβει ΒΝΝ27 (100 mg/kg) και στην ομάδα ελέγχου. Παρ’ όλα αυτά, παρατηρήσαμε για πρώτη φορά ότι στο μοντέλο της NMDA διεγερσιτοξικότητας η έκφραση του TrkA υποδοχέα είναι σημαντικά μειωμένη 24 ώρες μετά τον τραυματισμό.Η πολύ σημαντική μείωση του κυτταρικού θανάτου των φωτοϋποδοχέων στις 24 ώρες μετά την επαγωγή της πειραματικής αποκόλλησης υποδηλώνει ότι το ΒΝΝ27 πιθανόν να έχει σημαντική δράση στον οξύ τραυματισμό των κυττάρων αυτών, κάτι το οποίο ενισχύθηκε και από τα αποτελέσματα μας από το μοντέλο της NMDA διεγερσιτοξικότητας στο οποίο το ΒΝΝ27 μείωσε δραστικά τον κυτταρικό θάνατο αποκλειστικά των φωτοϋποδοχέων και όχι των άλλων κυττάρων του αμφιβληστροειδή. Ακόμα, στο μοντέλο της αποκόλλησης, το ΒΝΝ27 αύξησε σημαντικά τη φλεγμονή και τη γλοίωση, ενώ δεν φάνηκε να έχει κάποια επιρροή στις δύο αυτές συνιστώσες στο μοντέλο της διεγερσιτοξικότητας. Είναι σημαντικό να αναφερθεί ότι ο ρόλος των κυττάρων της φλεγμονής και της γλοίωσης στα νευροεκφυλιστικά νοσήματα παραμένει εν μέρει κατανοητός με τους πληθυσμούς αυτούς να έχουν και ευεργετικό αλλά και βλαβερό ρόλο, οπότε περαιτέρω μελέτες χρειάζονται για την αποσαφήνιση της δράσης του ΒΝΝ27 σε αυτούς τους πληθυσμούς κυττάρων. Ακόμα, σε αντίθεση με αποτελέσματα από άλλα νευροεκφυλιστικά νοσήματα, στον οξύ τραυματισμό του αμφιβληστροειδή δεν φαίνεται να ενεργοποιείται και κατ’ επέκταση να επάγεται η φωσφορυλίωση του TrkA υποδοχέα, υποδεικνύοντας ότι το BNN27 μπορεί να δρα μέσω άλλων υποδοχέων στα συγκεκριμένα δύο μοντέλα. Η έλλειψη ενεργοποίησης του TrkA και της downstream νευροπροστατευτικής σηματοδότησης με τη σειρά της μπορεί να είναι υπεύθυνη και για την απουσία μακροχρόνιας νευροπροστασίας. Συνοψίζοντας, η παρούσα εργασία δεν ήταν ικανή να καταλήξει αν το ΒΝΝ27 έχει νευροπροστατευτική δράση σε πειραματικά μοντέλα οξέων τραυμάτων του αμφιβληστροειδή. Περεταίρω ερευνητικές προσεγγίσεις είναι απαραίτητες για να αξιολογηθεί η δυνατότητα του ΒΝΝ27 ως νευροπροστατευτικό μόριο σε αμφιβληστροειδοπάθειες οι οποίες περιλαμβάνουν αποκόλληση του αμφιβληστροειδή ή διεγερσιτοξικότητα.