Κρυοσυντήρηση ανθρώπινων ωαρίων με τη μέθοδο της υαλοποίησης (vitrification): η επίδραση δυο συστημάτων υαλοποίησης (ανοικτού και κλειστού) στην αναπτυξιακή ικανότητα ωαρίων και εμβρύων και μελέτη της εφαρμογής τους σε κλινικές περιπτώσεις

Abstract

Vitrification is a cryopreservation technique. In this thesis we present our work on oocyte vitrification. Open and closed systems for human oocyte cryopreservation have been compared. Moreover, in order to examine the efficiency of vitrification on oocytes we compared clinically fresh and aseptically vitrified oocytes. In this project we included two experimental sets and three clinical trials. In the experimental sets we focused on determining the best protocol for vitrifying and warming human oocytes. When the appropriate protocol was set up, the clinical trials were generated. In the first trial a comparison of closed and open vitrified oocytes was performed. In order to maximize the importance of our findings we used sibling donated oocytes which vitrified either with open or with closed system. The second trial had as a purpose to explore the clinical efficiency of oocyte vitrification. A similar set up was adopted and sibling oocytes from the same donors were separated in two groups. One group involved patients that used fresh oocytes for their cycles and the second group included patients that used vitrified oocytes. Finally, a third trial was performed in order to examine whether the use of laser assisting hatching technique prior embryo transfer is beneficial. The purpose of this trial was to explore whether vitrification/warming induces zona pellucida hardening and whether laser assisting hatching could overcome this important barrier to implantation. A stepwise protocol for addition and removal of the cryoprotectants in and out of the cells is important in order to increase the biological and clinical efficiency of oocyte vitrification. Warming process was found to be as important as cooling. Closed devices for oocyte vitrification were proven to be as efficient as open. When the correct protocol was acquired, closed vitrified oocytes gave similar results to fresh oocytes. Finally, laser assisted hatching was found to be beneficial for the clinical result. Vitrification has been proven to be the gold standard technique for cryopreserving oocytes. The clinical results that were achieved after vitrification of oocytes were comparable to those deriving from fresh oocytes. The outcome of this research is very promising and could be used in order to give and answer to an everlasting debate between those that insist that open system vitrification is potentially harmful for the biological material and those that criticize the low cooling rate of closed system is lethal for the cells. Closed vitrification is a highly efficient technique and can replace open devices for human oocyte vitrification, leaving behind any concern regarding the biosafety of the human tissue.

Η υαλοποίηση είναι μία τεχνική κρυοσυντήρησης. Η διατριβή αυτή είχε σαν αρχικό στόχο να μελετήσει την εφαρμογή κλειστών και ανοιχτών συστημάτων υαλοποίησης στα ανθρώπινα ωάρια και να συγκρίνει τις τεχνικές μεταξύ τους. Επιπλέον, προκειμένου να εξεταστεί η κλινική αποτελεσματικότητα της υαλοποίησης των ωαρίων, συγκρίναμε με άμεσο τρόπο την επάρκεια των φρέσκων και υαλοποιημένων ωαρίων. Αυτή η διατριβή αποτελείται από δύο πειραματικά μέρη και από τρεις κλινικές μελέτες. Τα πειραματικά μέρη είχαν ως στόχο την ανεύρεση του καλύτερου πρωτόκολλου για την υαλοποίηση και αναθέρμανση των ανθρώπινων ωαρίων. Όταν το κατάλληλο πρωτόκολλο διαμορφώθηκε, οι κλινικές δοκιμές έλαβαν μέρος. Στην πρώτη κλινική μελέτη πραγματοποιήθηκε σύγκριση μεταξύ των κλειστών και ανοικτών συστημάτων υαλοποίησης. Προκειμένου να μεγιστοποιηθεί η σημαντικότητα των ευρημάτων μας, χρησιμοποιήσαμε αδελφά ωάρια από δωρεά που υαλοποιήθηκαν είτε με ανοιχτό είτε με κλειστό σύστημα. Η δεύτερη δοκιμή είχε ως σκοπό να διερευνήσει την κλινική αποτελεσματικότητα του ωαρίου υαλοποίησης. Μια παρόμοια μεθοδολογία με τη πρώτη μελέτη εγκρίθηκε και έτσι χρησιμοποιήθηκαν αδελφά ωάρια από την ίδια δότρια τα οποία χωρίστηκαν σε δύο ομάδες. Οι ασθενείς της πρώτης ομάδας έλαβαν τα φρέσκα ωάρια και της δεύτερης τα υαλοποιημένα. Τέλος, σε μια Τρίτη δοκιμή εξετάστηκε κατά πόσον η υποβοηθούμενη εκκόλαψη με χρήση λέιζερ λίγο πριν την μεταφορά εμβρύων που προέρχονται από υαλοποιημένα ωάρια είναι ευεργετική. Έμμεσος σκοπός αυτής της μελέτης ήταν να διερευνήσει κατά πόσον η υαλοποίηση δημιουργεί σκλήρυνση της διαφανούς ζώνης, προκαλώντας δυσκολία στην επίτευξη εκκόλαψης, δημιουργώντας έτσι ένα σημαντικό εμπόδιο για την εμφύτευση του εμβρύου. Η χρήση ενός πρωτοκόλλου με σταδιακή προσθήκη και απομάκρυνση των κρυοπροστατευτικών μέσα και έξω από τα κύτταρα είναι σημαντική και αυξάνει τη βιολογική και κλινική αποτελεσματικότητα των υαλοποιημένων ωαρίων. Οι υψηλοί ρυθμοί αναθέρμανσης βρέθηκαν να είναι εξίσου σημαντικοί με αυτούς της ψύξης. Οι κλειστού τύπου συσκευές για την υαλοποίηση ανθρώπινων ωαρίων αποδείχθηκε ότι είναι εξίσου αποτελεσματικές με τις ανοιχτού τύπου συσκευές. Τα υαλοποιημένα ωάρια, με κλειστού τύπου συσκευές, έδωσαν παρόμοια κλινικά αποτελέσματα με τα φρέσκα ωάρια. Τέλος, η υποβοηθούμενη εκκόλαψη με χρήση λέιζερ βρέθηκε να είναι επωφελής για τα κλινικά αποτελέσματα. Η υαλοποίηση αποτελεί την χρυσή επιτομή στην κρυοσυντήρηση των ωαρίων. Τα κλινικά αποτελέσματα που επιτεύχθηκαν μετά από υαλοποίηση ωοκυττάρων ήταν συγκρίσιμα με εκείνα που εξασφαλίζουν τα φρέσκα ωοκύτταρα. Το αποτέλεσμα αυτής της διατριβής είναι πολύ ενθαρρυντικά και θα μπορούσαν να αποτελέσουν την απάντηση σε μια διαρκή αντιπαράθεση μεταξύ εκείνων που επιμένουν ότι η ανοιχτού τύπου υαλοποίηση είναι δυνητικά επιβλαβής για το βιολογικό υλικό και εκείνων που επικρίνουν το χαμηλό ποσοστό ψύξης του κλειστού συστήματος, θεωρώντας πως είναι θανατηφόρο για τα κύτταρα. Η κλειστή τύπου υαλοποίηση είναι μια πολύ αποτελεσματική τεχνική και μπορεί να αντικαταστήσει την ανοιχτού τύπου υαλοποίηση, αφήνοντας πίσω κάθε ανησυχία σχετικά με τη βιολογική ασφάλεια των ανθρώπινων ιστών.