Μελέτη της επίδρασης σωματιδιακών συστατικών της ρύπανσης σε μηχανισμούς επιβίωσης κυττάρων ανθρώπου

Abstract

The effects of atmospheric pollutants on human health constitute an open research field for many decades. The majority of relevant studies focuses on particles with an aerodynamic diameter ≤10μm. Due to their size, these particles are able to penetrate and accumulate in the respiratory system, while the high «surface/mass» ratio allows the adsorption of various toxic compounds on their surface. Additional factors, such as conditions of exposure and individualized sensitivity, are crucial for the final outcome. The aim of this Ph.D. thesis was to assess the effects of particulate pollutants on human lung epithelial cells (A549), in order to identify early changes in cell physiology and signaling, which could contribute to cell transformation overtime. The responses of A549 were compared to those of human skin epithelial cells (A431), as well as of primary cultures of normal fibroblasts. We focused on two typical; cancer biomarkers, Akt and HIF-1α. The atmospheric pollutants studied were: 1) a mixture of PM10 from an industrial workplace, b) a standard mixture of Diesel Exhaust Particles (DEP) and c) the common pollutant, benzo[α]pyrene (B[α]P). B[α]P was selected as a representative component of the previous mixtures, in order to further investigate, its molecular mechanism of action.PM10 significantly decreased cell survival, in a way inversely related to particle diameter. The inorganic fraction had a more pronounced effect, which could be partly attributed to high concentration of SO42- and NH4+. Reduced cell survival was accompanied by decrease in Akt phosphorylation and HIF-1α protein levels.Low DEP concentrations resulted in mild oxidative stress and immediate accumulation of HIF-1α. Repetitive 2-hour exposures induced a cumulative increase of HIF-1α, which was sustained following DEP removal. The responses of normal lung fibroblasts, in a coculture system with A549, were of particular interest. Specifically, the paracrine communication between the two cell types resulted in a substantial induction of all the survival markers investigated.High doses of B[α]P induced mild cytotoxicity and extensive genotoxicity (DNA adducts and DNA fragmentation). Combined exposure to B[α]P and manufactured PLGA nanoparticles enhanced the toxicity of B[α]P, possibly by increasing its bioavailability. However, low doses of B[α]P promoted cell proliferation and upregulated NrF2, HIF-1α and Akt. Both NrF2 and HIF-1α were transcriptionally active. The response of HIF-1α to B[α]P was confirmed in the the cell line, A431, and in both lung and skin primary fibroblasts. Similar results were obtained during parallel exposure to B[α]P and stress conditions, such as hypoxia. Therefore, it seems that HIF-1α is an early marker of B[α]P effects and, interestingly, its induction was – at least partially – mediated by the PI3K/Akt pathway. Furthermore, B[α]P was shown to disturb Ca2+ homeostasis, increasing basal cytoplasmic ion levels, decreasing ion ER content and, thus, enhancing the potential of Ca2+ uptake. Ca2+ influx triggers acute Akt phosphorylation, contributing to the early accumulation of HIF-1α.

Η μελέτη των επιπτώσεων της ατμοσφαιρικής ρύπανσης στην υγεία συνιστά ένα πολυδιάστατο και πολυπαραγοντικό πρόβλημα. Η πλειοψηφία των σχετικών ερευνών επικεντρώνεται στα αιωρούμενα σωματίδια με αεροδυναμική διάμετρο ≤10μm. Tα σωματίδια αυτά συσσωρεύονται στα βαθύτερα σημεία του αναπνευστικού συστήματος, ενώ ο υψηλός λόγος «επιφάνεια/μάζα», επιτρέπει την προσρόφηση ποικίλων τοξικών ενώσεων στην επιφάνειά τους. Eξίσου σημαντικό ρόλο στις επιπτώσεις των σωματιδίων αυτών διαδραματίζουν και επιπλέον παράγοντες, όπως οι συνθήκες έκθεσης και η ατομική ευαισθησία.Σκοπός της παρούσας ΔΔ ήταν η καταγραφή των αποκρίσεων των επιθηλιακών κυττάρων πνεύμονα (Α549), παρουσία ρύπων, διαφορετικής προέλευσης και πολυπλοκότητας, προκειμένου να εντοπιστούν πρώιμες αλλαγές στην κυτταρική φυσιολογία και σηματοδότηση, που συμβάλλουν ενδεχομένως στην ανάπτυξη παθολογικού φαινοτύπου. Επιπλέον, πραγματοποιήθηκε συγκριτική καταγραφή της απόκρισης ανθρώπινων επιθηλιακών κυττάρων δέρματος (Α431) και αντίστοιχων φυσιολογικών ινοβλαστών. Ιδιαίτερη έμφαση δόθηκε στους τυπικούς καρκινικούς δείκτες, Αkt και ΗΙF-1α. Οι κατηγορίες ρύπων, που μελετήθηκαν, ήταν: α) ένα πολύπλοκο μικροσωματιδιακό μίγμα (ΡΜ10), από βιομηχανική εγκατάσταση, β) ένα μίγμα νανοσωματιδίων diesel (Diesel Exhaust Particles, DEP) και γ) ένα κοινό οργανικό συστατικό αυτών, το βενζο[α]πυρένιο (Β[α]Ρ). Το Β[α]Ρ χρησιμοποιήθηκε προκειμένου να διερευνηθεί περαιτέρω ο μηχανισμός δράσης των οργανικών ρύπων.Η μείωση της κυτταρικής επιβίωσης, παρουσία των ΡΜ10, ήταν αντιστρόφως ανάλογη της διαμέτρου των σωματιδίων. Η εντονότερη κυτταροτοξική δράση του ανόργανου κλάσματος θα μπορούσε, εν μέρει, να αποδοθεί στις υψηλές συγκεντρώσεις θειικών και αμμωνιακών ιόντων, που ανιχνεύθηκαν κατά τη χημική ανάλυση. Σε κάθε περίπτωση, παρατηρήθηκε, παράλληλη μείωση στη φωσφορυλίωση της Αkt και στα πρωτεϊνικά επίπεδα του HIF-1α.Τα DEP, σε μη κυτταροτοξικές συγκεντρώσεις, προκάλεσαν ήπιο οξειδωτικό στρες και άμεση συσσώρευση του ΗΙF-1α. Επαναλαμβανόμενες δίωρες επωάσεις έδρασαν αθροιστικά στα επίπεδα του ΗΙF-1α, τα οποία δεν επανήλθαν, μετά την απομάκρυνση των ρύπων για 22 ώρες. Οι αποκρίσεις των κυττάρων Α549 ήταν αντίστοιχες, σε σύστημα συγκαλλιέργειάς τους με φυσιολογικούς ινοβλάστες πνεύμονα. Η παρακρινική επικοινωνία των δύο κυτταρικών τύπων ενεργοποίησε όλους τους – υπό μελέτη – δείκτες επιβίωσης στους φυσιολογικούς ινοβλάστες, οι οποίοι δεν βρίσκονταν σε άμεση επαφή με τα νανοσωματίδια. Η μελέτη των επιπτώσεων της ατμοσφαιρικής ρύπανσης στην υγεία συνιστά ένα πολυδιάστατο και πολυπαραγοντικό πρόβλημα. Η πλειοψηφία των σχετικών ερευνών επικεντρώνεται στα αιωρούμενα σωματίδια με αεροδυναμική διάμετρο ≤10μm. Tα σωματίδια αυτά συσσωρεύονται στα βαθύτερα σημεία του αναπνευστικού συστήματος, ενώ ο υψηλός λόγος «επιφάνεια/μάζα», επιτρέπει την προσρόφηση ποικίλων τοξικών ενώσεων στην επιφάνειά τους. Eξίσου σημαντικό ρόλο στις επιπτώσεις των σωματιδίων αυτών διαδραματίζουν και επιπλέον παράγοντες, όπως οι συνθήκες έκθεσης και η ατομική ευαισθησία.Σκοπός της παρούσας ΔΔ ήταν η καταγραφή των αποκρίσεων των επιθηλιακών κυττάρων πνεύμονα (Α549), παρουσία ρύπων, διαφορετικής προέλευσης και πολυπλοκότητας, προκειμένου να εντοπιστούν πρώιμες αλλαγές στην κυτταρική φυσιολογία και σηματοδότηση, που συμβάλλουν ενδεχομένως στην ανάπτυξη παθολογικού φαινοτύπου. Επιπλέον, πραγματοποιήθηκε συγκριτική καταγραφή της απόκρισης ανθρώπινων επιθηλιακών κυττάρων δέρματος (Α431) και αντίστοιχων φυσιολογικών ινοβλαστών. Ιδιαίτερη έμφαση δόθηκε στους τυπικούς καρκινικούς δείκτες, Αkt και ΗΙF-1α. Οι κατηγορίες ρύπων, που μελετήθηκαν, ήταν: α) ένα πολύπλοκο μικροσωματιδιακό μίγμα (ΡΜ10), από βιομηχανική εγκατάσταση, β) ένα μίγμα νανοσωματιδίων diesel (Diesel Exhaust Particles, DEP) και γ) ένα κοινό οργανικό συστατικό αυτών, το βενζο[α]πυρένιο (Β[α]Ρ). Το Β[α]Ρ χρησιμοποιήθηκε προκειμένου να διερευνηθεί περαιτέρω ο μηχανισμός δράσης των οργανικών ρύπων.Η μείωση της κυτταρικής επιβίωσης, παρουσία των ΡΜ10, ήταν αντιστρόφως ανάλογη της διαμέτρου των σωματιδίων. Η εντονότερη κυτταροτοξική δράση του ανόργανου κλάσματος θα μπορούσε, εν μέρει, να αποδοθεί στις υψηλές συγκεντρώσεις θειικών και αμμωνιακών ιόντων, που ανιχνεύθηκαν κατά τη χημική ανάλυση. Σε κάθε περίπτωση, παρατηρήθηκε, παράλληλη μείωση στη φωσφορυλίωση της Αkt και στα πρωτεϊνικά επίπεδα του HIF-1α.Τα DEP, σε μη κυτταροτοξικές συγκεντρώσεις, προκάλεσαν ήπιο οξειδωτικό στρες και άμεση συσσώρευση του ΗΙF-1α. Επαναλαμβανόμενες δίωρες επωάσεις έδρασαν αθροιστικά στα επίπεδα του ΗΙF-1α, τα οποία δεν επανήλθαν, μετά την απομάκρυνση των ρύπων για 22 ώρες. Οι αποκρίσεις των κυττάρων Α549 ήταν αντίστοιχες, σε σύστημα συγκαλλιέργειάς τους με φυσιολογικούς ινοβλάστες πνεύμονα. Η παρακρινική επικοινωνία των δύο κυτταρικών τύπων ενεργοποίησε όλους τους – υπό μελέτη – δείκτες επιβίωσης στους φυσιολογικούς ινοβλάστες, οι οποίοι δεν βρίσκονταν σε άμεση επαφή με τα νανοσωματίδια.Υψηλές συγκεντρώσεις Β[α]Ρ εκδήλωσαν ήπια κυτταροτοξικότητα και εκτεταμένη γενοτοξική δράση (σχηματισμός προϊόντων προσθήκης και θραύση του γενετικού υλικού). Η αλληλεπίδραση με τα τεχνητά νανοσωματίδια PLGA ενισχύει τις επιπτώσεις των λιγότερο κυτταροτοξικών συγκεντρώσεων του ρύπου, πιθανά λόγο αύξησης της βιοδιαθεσιμότητάς του. Αντίθετα, μη κυτταροτοξικές συγκεντρώσεις Β[α]Ρ ευνοούν τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, μέσω του ήπιου οξειδωτικού στρες, και επάγουν τον ΗΙF-1α, μέσω του σηματοδοτικού μονοπατιού PI3Κ/Akt. Η επαγωγή των ΗΙF-1α και NrF2 συνοδεύεται από τη μεταγραφική τους ενεργοποίηση. Η απόκριση του ΗΙF-1α στο Β[α]Ρ επιβεβαιώθηκε και στα κύτταρα Α431, καθώς και σε πρωτογενείς καλλιέργειες φυσιολογικών ινοβλαστών δέρματος και πνεύμονα. Ανάλογα αποτελέσματα καταγράφηκαν και κατά την επίδραση του Β[α]Ρ, παρουσία επιπλέον στρεσογόνων συνθηκών, που χαρακτηρίζουν ποικίλες παθοφυσιολογικές καταστάσεις, όπως η υποξία. Τέλος, η αλληλεπίδρασή του Β[α]Ρ με διαύλους Ca2+, σε επίπεδο μεμβράνης, αυξάνει τα βασικά επίπεδα Ca2+ στο κυτταρόπλασμα και μειώνει το περιεχόμενο του ΕΔ ενισχύοντας το δυναμικό πρόσληψης ιόντων. Το σημειακό γεγονός της εισροής Ca2+, ενισχύει άμεσα τη φωσφορυλίωση της Αkt, συμβάλλοντας στην πρώιμη συσσώρευση του HIF-1α.