Gene networks underlying functional sex in Sparidae (Pisces, Teleostei): inference by comparative transcriptomics

Abstract

The differences between sexes and the concept of sex determination have always fascinated, yet troubled philosophers and scientists. Among the animals that reproduce sexually, teleost fishes show a very wide repertoire of reproductive modes. Except for the gonochoristic species, fish are the only vertebrates in which hermaphroditism appears naturally. Hermaphroditism refers to the capability of an organism to reproduce both as male and female in its life cycle and there are various forms of it. In sequential hermaphroditism, an individual begins as female first and then can change sex to become male (protogyny), or vice versa (protandry). The diverse sex-phenotypes of fish are regulated by a variety of sex determination mechanisms, along a continuum of environmental and heritable factors. The vast majority of sexually dimorphic traits result from the differential expression of genes that are present in both sexes. To date, studies regarding the sex-specific differences in gene expression have been conducted mainly in sex determination systems of model fish species that are well characterized at the genomic level, with distinguishable heteromorphic sex chromosomes, exhibiting genetic sex determination and gonochorism. Among teleosts, the Sparidae family is considered to be one of the most diversified families regarding its reproductive systems, and thus is a unique model for comparative studies to understand the molecular mechanisms underlying different sexual motifs. In this study, using RNA sequencing, we studied the transcriptome from gonads and brains of both sexes in five sparid species, representatives of four different reproductive styles. Specifically, we explored the sex-specific expression patterns of a gonochoristic species: the common dentex Dentex dentex, two protogynous hermaphrodites: the red porgy Pagrus pagrus and the common pandora Pagellus erythrinus, the rudimentary hermaphrodite sharpsnout seabream Diplodus puntazzo, and the protandrous gilthead seabream Sparus aurata. We found minor sex-related expression differences indicating a more homogeneous and sexually plastic brain, whereas there was a plethora of sex biased gene expression in the gonads. The functional divergence of the two gonadal types is reflected in their transcriptomic profiles, in terms of the number of genes differentially expressed, as well as the expression magnitude (i.e. fold-change differences). The observation of almost double the number of up-regulated genes in males compared to females indicates a male-biased expression tendency. Focusing on the pathways and genes implicated in sex determination/differentiation, we aimed to unveil the molecular pathways through which these non-model fish species develop a masculine or a feminine character. We observed the implicated pathways and major gene families (e.g. Wnt/b-catenin pathway and Retinoic-acid signaling pathway, Notch, TGFβ) behind sex-biased expression and the recruitment of known sex-related genes either to male or female type of gonads in these fish. (e.g Dmrt1, Sox9, Sox3, Cyp19a, Filgla, Ctnnb1, Gsdf9, Stra6 etc.). We also carefully investigated the presence of genes reported to be involved in sex determination/differentiation mechanisms in other vertebrates and fish and compared their expression patterns in the species under study. The expression profiling exposed known candidate molecular-players/genes establishing the common female (Cyp19a1, Sox3, Figla, Gdf9, Cyp26a, Ctnnb1, Dnmt1, Stra6) and male identity (Dmrt1, Sox9, Dnmt3aa, Rarb, Raraa, Hdac8, Tdrd7) of the gonad in these sparids. Additionally, we focused on those contributing to a species-specific manner either to female (Wnt4a, Dmrt2a, Foxl2 etc.) or to male (Amh, Dmrt3a, Cyp11b etc.) characters, and discussed the expression patterns of factors that belong to important pathways and/or gene families in the SD context, in our species gonadal transcriptomes. Taken together, most of the studied genes form part of the cascade of sex determination, differentiation, and reproduction across teleosts. In this study, we focused on genes that are active when sex is established (sex-maintainers), revealing the basic “gene-toolkit” & gene-networks underlying functional sex in these five sparids. Comparing related species with alternative reproductive styles, we saw different combinations of genes with conserved sex-linked roles and some “handy” molecular players, in a “partially- conserved” or “modulated” network formulating the male and female phenotype. The knowledge obtained in this study and tools developed during the process have set the groundwork for future experiments that can improve the sex control of this species and help the in-deep understanding the complex process of sex differentiation in the more flexible multi-component systems as these studied here.

Οι διαφορές ανάμεσα στα δύο φύλα και ο καθορισμός του φύλου ανέκαθεν γοήτευαν και την ίδια στιγμή προβλημάτιζαν φιλοσόφους και επιστήμονες. Ο τρόπος με τον οποίο ορίζονται τα δύο φύλα είναι από την παρουσία και το μέγεθος ορισμένων εξειδικευμένων απλοειδών κυττάρων που ονομάζονται γαμέτες. Η αναπαραγωγή με σεξουαλικό τρόπο απαιτεί τουλάχιστον ένα άτομο με μεγάλο γαμέτη (θηλυκό) και ένα άτομο με μικρό γαμέτη (αρσενικό). Στα περισσότερα είδη ζώων αυτά τα απλοειδή κύτταρα παράγονται σε ένα συγκεκριμένο όργανο, την γονάδα. Το αρχικό έναυσμα για το αν ένα έμβρυο θα γίνει αρσενικό ή θηλυκό και η επακόλουθη διαμόρφωση της αδιαφοροποίητης γονάδας σε όρχη ή ωοθήκη είναι οι δύο κύριες διεργασίες που λαμβάνουν χώρα κατά την ανάπτυξη του φύλου. Το έναυσμα για το αν η πρώιμη και αδιαφοροποίητη γονάδα θα γίνει όρχεις ή ωοθήκες συνηθίζεται να αποκαλείται φυλοκαθορισμός (Sex Determination) και η διαδικασία που ακολουθεί τον φυλοκαθορισμό και κατευθύνει την ανάπτυξη των όρχεων ή των ωοθηκών, αποκαλείται διαφοροποίηση του φύλου (Sex Differentiation). Οι μηχανισμοί για τον καθορισμό του φύλου, ποικίλουν εξαιρετικά μεταξύ των οργανισμών. Οι παραλλαγές αυτές και τα διάφορα συστήματα φυλοκαθορισμού δεν συνηθίζεται να ομαδοποιούνται μέσα στην ίδια εξελικτική γραμμή (π.χ. σε είδη μιας οικογένειας), αλλά βρίσκονται διασκορπισμένα στο φυλογενετικό δέντρο, γεγονός που υποδηλώνει ότι αυτοί οι μηχανισμοί έχουν εξελιχθεί επανειλημμένα. Επιπλέον, πολύ συγγενικά είδη έχουν αναπτύξει διαφορετικούς μηχανισμούς φυλοκαθορισμού, γεγονός που υποδηλώνει ότι υπάρχει χαμηλό εμπόδιο στις μεταβάσεις μεταξύ των συστημάτων.Μεταξύ των ψαριών, η οικογένεια Sparidae θεωρείται, όσον αφορά τους διαφορετικούς τρόπους αναπαραγωγής, μια από τις πιο ποικιλόμορφες οικογένειες καθώς σε αυτήν απατώνται σχεδόν όλα τα γνωστά αναπαραγωγικά μοτίβα που συναντάμε στον κλάδο των τελεόστεων. Αποτελεί έτσι μια οικογένεια - μοντέλο για συγκριτικές μελέτες σχετικές με τους μοριακούς μηχανισμούς πίσω από τα διάφορα αναπαραγωγικά μοτίβα και συστήματα. Παρά τις εκτεταμένες φαινοτυπικές διαφορές μεταξύ των φύλων, τα θηλυκά και τα αρσενικά είναι σχεδόν ταυτόσημα γενετικά. Στα περισσότερα είδη, τα αρσενικά και θηλυκά γονιδιώματα διαφέρουν μόνο σε μερικά γονίδια που βρίσκονται στα φυλετικά χρωμοσώματα. Ενώ σε είδη χωρίς γενετικό φυλοκαθορισμό, τα γονιδιώματα είναι τελείως όμοια. Έτσι, η συντριπτική πλειοψηφία των φυλετικών διμορφικών χαρακτηριστικών προκύπτει από τη διαφορική έκφραση των γονιδίων που υπάρχουν και στα δύο φύλα. Πολλά γονίδια μεταγράφονται σε μεγαλύτερο βαθμό στο ένα φύλο από ότι στο άλλο. Αυτή η διαφορά στην έκφραση των γονιδίων μεταξύ των δύο φύλων είναι και ο μηχανισμός με τον οποίο κληρονομήσιμες διαφορές μεταξύ των φύλων (αυτό που καλούμε φυλετικό διμορφισμό) μπορούν να προκύψουν από ένα κατά το πλείστον πανομοιότυπο γονιδίωμα. Τα γονίδια με διμορφική έκφραση στα δύο φύλα συχνά αναφέρονται ως “sex-biased” γονίδια, αν και δεν είναι τα ίδια τα γονίδια που είναι “sex-biased”, αλλά η έκφρασή τους. Οι γνώσεις σχετικά με τις διαφορές των δύο φύλων σε μοριακό επίπεδο έχουν προκύψει από μελέτες στον άνθρωπο, σε μοντέλα οργανισμούς όπως το ποντίκι, την κότα και τον Αφρικανικό ονυχοφόρο βάτραχο. Ομοίως στα ψάρια, μελέτες που αφορούν την διαφορική έκφραση γονιδίων στα δύο φύλα έχουν διεξαχθεί κυρίως σε: συστήματα φυλοκαθορισμού μοντέλων ιχθύων, τις περισσότερες φορές καλά χαρακτηρισμένων σε γενωμικό επίπεδο, με διακριτά ετερομορφικά φυλετικά χρωμοσώματα, που έχουν γενετικό σύστημα φυλοκαθορισμού και είναι γονοχωριστικά. Τέτοια γονίδια περιλαμβάνουν: το DmY/Dmrt1bY στα Oryzias latipes και Oryzias curvinotus, το Gsdf στο Oryzias luzonensis, το Amhy στο Odontesthes hatcheri, το Amhr2 στα Takifugu rubripes, Takifugu pardalis και Takifugu poecilonotus και το SdY στην ιριδίζουσα πέστροφα, Oncorhynchus mykiss. Προσφάτως αναγνωρίστηκε ένα απομακρυσμένο cis-ρυθμιστικό στοιχείο του Sox3 γονιδίου, υπεύθυνο για την ανάπτυξη του αρσενικού φαινοτύπου στην Oryzias dancena (XX/XY σύστημα φυλοκαθορισμού), ενώ το Dmrt1 έχει προταθεί ως ρυθμιστικό γονίδιο του φύλου στο είδος γλώσσας Cynoglossus semilaevis (ZZ/ZW σύστημα φυλοκαθορισμού). Η πρώτη εργασία πάνω σε φυλο-εξαρτώμενη γονιδιακή έκφραση σε είδη της οικογένειας Sparidae ήταν στο στοιχειώδες (rudimentary)* ερμαφρόδιτο μυτάκι, Diplodus puntazzo. Οι στόχοι αυτής της εργασίας κατηγοριοποιούνται σε τρία βασικά θέματα: 1) Πρώτος στόχος ήταν να μελετήσουμε τις διαφορές σε επίπεδο έκφρασης γονιδίων μεταξύ αρσενικών και θηλυκών σε 5 είδη της οικογένειας Sparidae. Πιο συγκεκριμένα, θέλαμε να ερευνήσουμε διαφορές στην γονιδιακή έκφραση μεταξύ αρσενικών και θηλυκών γονάδων και εγκεφάλων, ιστών με τον πιο κυρίαρχο ρόλο στην διαφοροποίηση του φύλου και στην αναπαραγωγή. 2) Να μελετήσουμε τα γονιδιακά δίκτυα (δηλ. γονίδια και τα μονοπάτια) που εμπλέκονται στον φαινότυπο του φύλου στα είδη αυτά. Με απώτερο σκοπό την αναζήτηση μοριακών καθοριστών του φύλου. Και έτσι, 3) να αποκτήσουμε μια όσο το δυνατόν συνολικότερη εικόνα για το σύστημα φυλοκαθορισμού σε αυτούς τους οργανισμούς που εμφανίζουν τόσο ιδιαίτερα αναπαραγωγικά μοτίβα. Στην παρούσα μελέτη, εξερευνήσαμε τις διαφορές μεταξύ των δύο φύλων σε επίπεδο έκφρασης γονιδίων, σε 5 είδη της οικογένειας Sparidae, αντιπροσώπων τεσσάρων διαφορετικών αναπαραγωγικών μοτίβων: Η γονοχωριστική συναγρίδα Dentex dentex, τα πρωτόγυνα λυθρίνι Pagellus erythrinus και φαγκρί Pagrus pagrus, το στοιχειώδες ερμαφρόδιτο μυτάκι Diplodus puntazzo και η πρώτανδρη τσιπούρα Sparus aurata. Μεσω της αλληλούxησης του RNA, αναλύσαμε και συγκρίναμε διαφορές μεταξύ των μεταγραφωμάτων σε αρσενικά και θηλυκά άτομα των ειδών μελέτης. Πιο συγκεκριμένα, ερευνήσαμε διαφορές στην γονιδιακή έκφραση μεταξύ αρσενικών και θηλυκών γονάδων και εγκεφάλων, ιστών με τον πιο κυρίαρχο ρόλο στην διαφοροποίηση του φύλου και στην αναπαραγωγή. Πετύχαμε να έχουμε μια συνολική εικόνα της φυλο-εξαρτώμενης έκφρασης γονιδίων στον εγκέφαλο και στις γονάδες. Μέσω συγκριτικής ανάλυσης αποκαλύφθηκαν ειδικά για τα αρσενικά (male-biased) και ειδικά για τα θηλυκά (female-biased) γονίδια και μονοπάτια, μεταξύ των οργανισμών μελέτης. Μέσω εκτενούς βιβλιογραφικής μελέτης, συλλέξαμε και παρατηρήσαμε τα μοτίβα έκφρασης γνωστών υποψήφιων γονιδίων, βασικών συντελεστών στον φυλοκαθορισμό και την διαφοροποίηση του φύλου σε άλλα ψάρια και σπονδυλωτά, αποκαλύπτοντας έτσι την γονιδιακή εργαλειοθήκη που ευθύνεται για την εγκαθίδρυση του φύλου (του αρσενικού και θηλυκού φαινοτύπου) στους 5 αυτούς ιχθύες. Η συνολική εικόνα του προτύπου έκφρασης (expression pattern) στον εγκέφαλο και στις γονάδες για όλα τα δείγματα των ειδών που αναλύθηκαν αποτυπώνεται με την μορφή PCA (Principal Component Analysis) γραφημάτων και heatmap plots (για την δημιουργία αυτών των PCA διαγραμμάτων χρησιμοποιήθηκαν όλα τα γονίδια που εξετάστηκαν για διαφορική έκφραση ανάμεσα σε αρσενικά και θηλυκά). Για όλα τα είδη, τα διαγράμματα που προέκυψαν δείχνουν την ύπαρξη τριών διαφορετικών ομάδων: τους εγκεφάλους (αρσενικοί και θηλυκοί μαζί), τις αρσενικές και τις θηλυκές γονάδες. Ενώ οι δύο τύποι γονάδων ομαδοποιούνται ξεχωριστά δείχνοντας μια αξιοσημείωτη διαφοροποίηση μεταξύ των δύο φύλων, oι εγκέφαλοι αρσενικών και θηλυκών ομαδοποιούνται μαζί, δείχνοντας πολύ όμοια πρότυπα έκφρασης. Η ανάλυση αποκαλύπτει μικρές διαφορές στην έκφραση μεταξύ αρσενικών και θηλυκών στον εγκέφαλο. Γενικά, τα διαφορικά εκφραζόμενα γονίδια στον εγκέφαλο είναι και σχετικά λίγα στον αριθμό αλλά και η ένταση διαφορικής έκφρασης τους μικρή, όπως αποκαλύπτεται από τις λογαριθμικές διαφορές. Παρά τις μικρές διαφορές έκφρασης μεταξύ των δύο φύλων στο εγκέφαλο, βρήκαμε κάποια γονίδια άξια σχολιασμού: Όπως ο "early growth response factor 1 και 4" και το "proto-oncogene c-Fos" που βρέθηκαν να υπερεκφράζονται στους εγκεφάλους των θηλυκων πρωτόγυνων (red porgy & common pandora). Αυτά τα γονίδια που χαρακτηρίζονται ως immediate-early genes, σχετίζονται με διαφορές στην εγκεφαλική δραστηριότητα και με αντίστοιχες γενωμικές αποκρίσεις σε κοινωνικά σήματα, συμπεριφορικά σήματα, σήματα που ανταλλάσσονται κατά το ζευγάρωμα. Επίσης, στον εγκέφαλο των αρσενικών ατόμων της τσιπούρας βρήκαμε να υπερ-εκφράζονται τα "vasotocin-neurophysin VT 1-like" και "isotocin-neurophysin IT 1-like" γονίδια που σχετίζονται με κοινωνικές στερεοτυπικές συμπεριφορές των αρσενικών σε διάφορα είδη σπονδυλωτών. Χαρακτηριστική αρσενική έκφραση σε όλα τα είδη που μελετήθηκαν είχαν δύο παράγοντες: Prkce (Protein kinase C epsilon type) και EphA4 (Ephrin type-A receptor 4)· και οι δύο αυτοί παράγοντες εμπλέκονται και σηματοδοτούν μονοπάτια διαφόρων κινασών, που ο ρόλος αυτών των μονοπατιών έχει βρεθεί σε μελέτες θηλαστικών να παίζει σημαντικό ρόλο στον φυλοκαθορισμό.Οι γονάδες είναι ο ιστός που διαφέρει περισσότερο μεταξύ των δύο φύλων. Παρά την ευελιξία του γοναδικού ιστού στα είδη που αναστρέφουν το φύλο, και παρά το γεγονός ότι οι όρχεις και οι ωοθήκες προέρχονται από τον ίδιο πρόδρομο ιστό, όταν το φύλο έχει εγκαθιδρυθεί πρόκειται για δύο εντελώς διαφορετικούς λειτουργικά τύπους ιστού. Η λειτουργική και όχι μόνο απόκλιση των δύο τύπων ιστού αντικατοπτρίζεται και στα μεταγραφωματικά τους προφίλ. Η παρατήρηση του σχεδόν διπλάσιου αριθμού γονιδίων που υπερ-εκφράζονται στους όρχεις σε σχέση με αυτά στις ωοθήκες υποδηλώνει μια “male-biased” τάση έκφρασης στις γονάδες. Όλο και περισσότερες έρευνες που μελετούν φυλο-ειδικές/φυλο-εξαρτώμενες διαφορές έκφρασης στα ψάρια υπογραμμίζουν αυτήν την τάση. Στην περίπτωση των ψαριών που μελετώνται εδώ, τα οποία δεν έχουν φυλετικά χρωμοσώματα και δεν εμφανίζουν κάποιο σταθερό σύστημα καθαρά γενετικού φυλοκαθορισμού, αυτή η τάση πρέπει να μελετηθεί εις βάθος καθώς ενδέχεται να εξηγεί πολλά για την διαμόρφωση και διατήρηση της αρσενικής ή θηλυκής ταυτότητας της γονάδας.Θέλοντας να εστιάσουμε σε συγκεκριμένα γονίδια και μονοπάτια που εμπλέκονται στον φυλοκαθορισμό και την διαφοροποίηση του φύλου στις γονάδες, συνδυάσαμε την πληροφορία από την ανάλυση εμπλουτισμού και την στοχευμένη ανάλυση του μεταγραφώματος (enrichment and targeted analysis) καθώς και την υπάρχουσα βιβλιογραφική πληροφορία για να καταλήξουμε σε μια λίστα 114 γνωστών γονιδίων που σχετίζονται με την αναπαραγωγή, τον φυλοκαθορισμό και τη διαφοροποίηση του φύλου όπως έχει βρεθεί σε άλλα είδη ψαριών, σπονδυλωτών και θηλαστικών. Στη συνέχεια, μελετήσαμε τα πρότυπα έκφρασης αυτών των γονιδίων στις γονάδες των οργανισμών μελέτης. Εκτός των συγκεκριμένων γονιδίων που προέκυψαν από την “χειροκίνητη” θα λέγαμε ανάλυση, κοιτάξαμε τη διαφορική έκφραση γονιδίων στις γονάδες σε μια συγκριτική προσέγγιση όλου του μεταγραφώματος (“whole-transcriptome”). Αφού βρήκαμε τα ορθόλογα γονίδια στα μεταγραφώματα των 5 οργανισμών, εισαγάγαμε την πληροφορία έκφρασης καθώς και τον βιολογικό χαρακτηρισμό (πληροφορία που προέκυψε από τον λειτουργικό σχολιασμό του μεταγραφώματος) και βρήκαμε 1418 ορθόλογα γονίδια να υπερ-εκφράζονται στους όρχεις και 1665 ορθόλογα γονίδια να υπερ-εκφράζονται στις ωοθήκες και των 5 οργανισμών. Γονίδια που φαίνεται να έχουν εναν συντηρημένο ρόλο στο να ορίζουν την αρσενική ή θηλυκή ταυτότητα της γονάδας σε αυτή την οικογένεια τελεόστεων. Ξεκινώντας από την διαμόρφωση και εγκαθίδρυση του θηλυκού φαινότυπου, που από πολλούς θεωρείται και το “προεπιλεγμένο” φύλο (τουλάχιστον στα θηλαστικά), το γονίδιο της αρωματάσης των γονάδων (gonadal aromatase gene, Cyp19a1a), είναι ίσως το γονίδιο με τον πιο πρωταγωνιστικό ρόλο για την τύχη της γονάδας. Στην εργασία αυτή, βρίσκουμε μιας υψηλής έντασης υπερ-εκφραση του γονιδίου της αρωματάσης στις ωοθήκες, στα άτομα όλων των ειδών που εξετάστηκαν. Στα ψάρια, η αρωματάση επιτελεί έναν σημαντικότατο ρόλο στην ανάπτυξη και διαφοροποίηση των ωοθηκών. Η χαρακτηριστική θηλυκή έκφραση της έχει αναφερθεί σε πολλά γονοχωριστικά άλλα και ερμαφρόδιτα είδη, γεγονός που υπογραμμίζει την εμπλοκή της στην διαφοροποίηση των γονάδων αλλά και στην αναστροφή του φύλου. Η αρωματάση μαζί με τα οιστρογόνα ρυθμίζουν και ελέγχουν όχι μόνο την διαφοροποίηση των ωοθηκών αλλά και με αντίστροφο τρόπο των όρχεων. Έχοντας μια κεντρική θέση στο δίκτυο γονιδίων υπεύθυνων για το φύλο, η αρωματάση συνδέει πολλαπλά μονοπάτια μέσα στο δίκτυο και πολλοί κλασικοί μεταγραφωματικοί παράγοντες ελέγχουν και επηρεάζουν την έκφραση της (πχ. αυτόν της Foxl2). Εκτός αυτού όμως, η έκφραση της ελέγχεται και από επιγενετικούς παράγοντες. Αλλαγές στα επίπεδα μεθυλίωσης στον εκκινητή της αρωματάσης, ρυθμίζουν τα επίπεδα έκφρασης της σε θερμο-εξαρτώμενα συστήματα φυλοκαθορισμού. Η αρωματάση η οποία μοιάζει να αποτελεί μια συγκλίνουσα ανάγνωση που υποδηλώνει την δέσμευση στο θηλυκό μονοπάτι τόσο στα ψάρια όσο και στα ερπετά, αντιπροσωπεύει έναν μοριακό συνδετικό κρίκο μεταξύ περιβάλλοντος και του μοριακού συστήματος φυλοκαθορισμού. Ένας παράγοντας του θηλυκού μονοπατιού, φαίνεται να είναι επίσης ο Figla (factor in germ-line alpha), καθώς εκφράζεται σε υψηλά επίπεδα στις ωοθήκες όλων των ειδών της παρούσας μελέτης. Το γονίδιο Figla κωδικοποιεί έναν μεταγραφικό παράγοντα που ρυθμίζει την έκφραση ειδικών γονιδίων των ωοκυττάρων “zona pellucida genes” και συνεπώς ρυθμίζει την ωοθυλακιογένεση. Εκτός από τον ευρέως αποδεκτό του ρόλο στο να προωθεί την ανάπτυξη των ωοθηκών, έχει επίσης την ικανότητα να καταστέλλει την σπερματογένεση και έτσι να ενεργεί ως ανταγωνιστικός παράγοντας του αρσενικού μονοπατιού. Επιπλέον, έχει προταθεί ότι ο παράγοντας Figla εμφανίζει μια αντιπαράλληλη κατεύθυνση έκφρασης με το Dmrt1 (πολύ σημαντικό γονίδιο που προωθεί την αρσενική ανάπτυξη) κατά τη μετάβαση από το αρσενικό στο θηλυκό και αντιστρόφως, στο πρώτανδρο Acanthopagrus schlegelii και στο πρωτόγυνο είδος Halichoeres poecilopterus. Η συσχέτιση του γονιδίου Figla με επιγενετικούς μηχανισμούς μέσω εναλλακτικού ματίσματος στο είδος γλώσσας Cynoglossus semilaevis, αποτελεί παράδειγμα για το πως συντηρημένοι γενετικοί παράγοντες σε σταθερά συστήματα γενετικού καθορισμού του φύλου (GSD) μπορούν να χρησιμοποιηθούν από συστήματα περιβαλλοντικού καθορισμού του φύλου (ESD). Στην θηλυκή “ομάδα” βρήκαμε επίσης ένα βασικό παράγοντα του Wnt/b-catenin μονοπατιού, το γονίδιο της Catenin-beta 1. Στα θηλαστικά, το μονοπάτι αυτό έχει συνδεθεί με την ανάπτυξη ωοθηκών, ενώ στα ψάρια η σύνδεση αυτού του μονοπατιού με το θηλυκό στοιχείο, δεν είναι κανόνας. Η παρούσα μελέτη επιβεβαιώνει ότι το Wnt / b-catenin μονοπάτι έχει ενεργό ρόλο στη διαφοροποίηση της γονάδας σε όλα τα είδη που μελετήσαμε, με βάση την ανάλυση εμπλουτισμού. Ωστόσο, μόνο η Ctnnb1 έδειξε ένα σταθερό μοτίβο, υπερ-έκφρασης στις θηλυκές γονάδες σε όλα τα είδη. Αυτό καταδεικνύει τον συντηρημένο και σημαντικό ρόλο της Ctnnb1 προς την διατήρηση της θηλυκής ταυτότητας της γονάδας, τουλάχιστον σε αυτή την ομάδα ιχθύων. Το γονίδιο της Wnt4 βρέθηκε να εκφράζεται στις θηλυκές γονάδες του γονοχωριστικού είδους (συναγρίδα, Dentex dentex) αλλά και στα δύο πρωτόγυνα (φαγκρί, Pagrus pagrus και λυθρίνι Pagellus erythrinus), ενώ δεν βρέθηκε στο μεταγράφωμα του μυτακιού, Diplodus puntazzo αλλά και της τσιπούρας, Sparus aurata. Επιπλέον, το Rspo1 δεν εμφάνισε διαφορές στην έκφραση μεταξύ αρσενικών και θηλυκών γονάδων σε όλα τα είδη εκτός της συναγρίδας που βρέθηκε να υπερ-εκφράζεται στους όρχεις. Το γονίδιο της Ctnnb1 είναι πιο “downstream” γονίδιο στο WNT-μονοπάτι στα θηλαστικά και τα Wnt4 και Rspo1 ενεργούν μέσω αυτού, χρησιμοποιώντας το ως μεσολαβητή. Αυτό το γεγονός, εγείρει την πιθανότητα ο ρόλος του Ctnnb1 στην θηλυκή ανάπτυξη, σε αυτή την ομάδα ψαριών να είναι περισσότερο συντηρημένος σε σχέση με τους πιο upstream παράγοντες Wnt4 και Rspo1. Παρομοίως με το Wnt/b-catenin μονοπάτι, ο ρόλος του μονοπατιού ρετινοϊκού οξέος στον φυλοκαθορισμό και ειδικά στην διαφοροποίηση των θηλυκών γονάδων έχει επισημανθεί πολλές φορές. Επιβεβαιώνεται επίσης και από τα ευρήματα του παρόντος διδακτορικού. Ο ρόλος αυτού του μονοπατιού είναι σημαντικός στην διαφοροποίηση των ωοθηκών διότι το ρετινοϊκό οξύ ελέγχει την έναρξη της μείωσης των γεννητικών κυττάρων. Δύο μέλη αυτού του μονοπατιού, η Cyp26a και το Stra6 έδειξαν να υπερ-εκφράζονται στον θηλυκό ιστό και στα 5 είδη που μελετήσαμε. Προσφάτως, μελέτη στην τιλάπια του Νείλου, Oreochromis niloticus έδειξε ότι ο ομοιοστατικός μηχανισμός που ενεργοποιείται από το retinoic acid gene 8 (Stra8), και εμπλέκει την Cyp26a1 και τη Aldh1a2, μεσολαβεί για να εισέλθουν τα γεννητικά κύτταρα στην μείωση. Ενώ το Stra8 απουσιάζει από τα μεταγραφώματα όλων των ειδών που μελετήσαμε εδώ, το Stra6 ήταν παρόν και μάλιστα υπερ-εκφράζονταν στις θηλυκές γονάδες. Ενας ακόμη μεταγραφικός παράγοντας που τάσσεται υπέρ της θηλυκής πλευράς, είναι ο Gdf9 (growth differentiation factor-9). Ο Gdf9 βρέθηκε να υπερ-εκφράζεται στις ωοθήκες όλων των ειδών που εξετάστηκαν. Ευρήματα σε συμφωνία με αυτά στο πρωτόγυνο είδος Λαβρύδων, Thalassoma bifasciatum. Αυτό το μέλος της υπερ-οικογένειας των TGFβ παραγόντων, είναι ένας χαρακτηριστικός θηλυκός παράγοντας που συσχετίζεται με τα ωοκύτταρα και την θηλυκή γονάδα σε διάφορα σπονδυλωτά συμπεριλαμβανομένων των θηλαστικών, την κότα, και το zebrafish. Ως αναπτυξιακός παράγοντας, είναι υπεύθυνος για ωοθυλακιογένεση στα ποντίκια, ενώ στο zebrafish, Danio rerio παίζει επίσης τον ρόλο του “προστάτη του θηλυκού ιστού” καταστέλλοντας την απόπτωση που συμβαίνει στον ωοθηκικό ιστό ώστε να αρχίσει η ανάπτυξη του αρσενικού ιστού. Επίσης, δύο βασικοί παράγοντες των Sox γονιδίων, το Sox3 και το Sox9 βρέθηκαν στις γονάδες ανάμεσα στα κοινά εκφραζόμενα γονίδια μεταξύ όλων των ειδών. Το Sox3 βρέθηκε να υπερ-εκφράζεται στις ωοθήκες και των 5 σπαροειδών. Τα Sox γονίδια είναι εξαιρετικά συντηρημένα εξελικτικά και κωδικοποιούν μια ομάδα πρωτεϊνών που είναι γνωστοί μεταγραφικοί ρυθμιστές, εμπλέκονται στην απόφαση της κυτταρικής μοίρας κατά την ανάπτυξη και στον έλεγχο διαφόρων αναπτυξιακών διεργασιών. Μελέτες στα θηλαστικά θέλουν το Sox3 να επάγει τον σχηματισμό των όρχεων και της σπερματογένεσης. To γνωστό γονίδιο στο Y χρωμόσωμα, Sry, θεωρείται ότι έχει εξελιχθεί απο το αυτοσωμικό παραλλαγμένο αλληλόμορφο του Sox3 στο proto-Y χρωμόσωμα στον κλάδο των θηλαστικών (therian mammals). Επιπροσθέτως, σε ένα είδος συγγενικό του medaka, Oryzias dancena. έχει προταθεί ένας μηχανισμός με το Sox3 να έχει τον ρόλο, ειδικού στα αρσενικά, κεντρικού ρυθμιστή. Παρόλα αυτά, ο ακριβής ρόλος, θέση και λειτουργία του Sox3 στα ψάρια παραμένει άγνωστος. Πράγματι, αντικρουόμενα αποτελέσματα θέλουν το γονίδιο αυτό κάποιες φορές να συνδέεται με τον αρσενικό φαινότυπο ενώ άλλες με τον θηλυκό. Η ικανότητα του Sox3 να δρα δίνοντας το έναυσμα και η καταλληλότητα του στο να δημιουργεί νέα φυλοκαθοριστικά γονίδια το κάνει έναν ξεχωριστό υποψήφιο. Απαιτούνται βέβαια κι άλλες μελέτες για να δειχθεί ο ρόλος αυτού του γονιδίου στην διαφοροποίηση των γονάδων στα σπαροειδή, που συμφωνα με τα ευρήματα του παρόντος διδακτορικού φαίνεται στηρίζει την θηλυκή ανάπτυξη. Οσον αφορά γονίδια στις αρσενικές γονάδες, στους όρχεις και των πέντε ειδών υπερ-εκφράστηκε το Sox9 γονίδιο. Ανήκει στην ίδια οικογένεια παραγόντων, και εμπλέκεται στην διαφοροποίηση των όρχεων και στην διατήρηση της αρσενικής γονιμότητας στα θηλαστικά. Αποτελέσματα σε δύο άλλα ερμαφρόδιτα είδη, το πρωτόγυνο bluehead wrasse και το πρώτανδρο ψάρι κλόουν Amphiphrion bicinctus, επιβεβαιώνουν την αρσενική του έκφραση. Σε αντίθεση, το ομόλογο του Sox9 στο medaka, Oryzias latipes υπερ-εκφράζεται στα ωοκύτταρα, ενώ στο zebrafish, Danio rerio υπάρχουν δύο ομόλογα. Το ένα εκφράζεται στα κύτταρα Sertoli των όρχεων ενώ το άλλο στα ωοκύτταρα. Εδώ το ομόλογο του medaka ενώ βρέθηκε στο μεταγράφωμα όλων των σπαροειδών, δεν έδειξε κάποια διαφορά έκφρασης στα δύο φύλα. Ενδιαφέρον είναι ότι το ορθόλογο της tilapia και του tetraodon είχε την ίδια αρσενική υπερ-έκφραση. H πληθώρα μεταγραφικών παραγόντων Sox με διαφορετικά μέλη Sox να ενεργοποιούν παρόμοια γονίδια-στόχους, καθώς και η επέκταση αυτών των παραγόντων στα ψάρια μετά το διπλασιασμό του γονιδιώματος που συνέβη στον κλάδο των τελεόστεων, καθιστά αυτούς τους παράγοντες “εύχρηστα” μοριακά εργαλεία. Τα δεδομένα αυτά, μας οδηγούν στο συμπέρασμα ότι τα Sox3 and Sox9 είναι απαραίτητα στην διαμόρφωση του θηλυκού και αρσενικού φαινοτύπου αντίστοιχα, στα είδη που μελετήσαμε, αλλά και ότι και τα δύο γονίδια αποτελούν “εύχρηστα” εργαλεία που μπορούν να παίξουν πολλαπλούς ρόλους στην μοριακή μηχανή φυλοκαθορισμού.Τα γονίδια Dmrt εμπλέκονται ενεργά στον μηχανισμό διαφοροποίησης του φύλου σε σπονδυλωτά, ασπόνδυλα και σε όλους τους τελεόστεους που έχουν μελετηθεί μέχρι σήμερα. Αν φανταστούμε τη διαδικασία του φυλοκαθορισμού και της σεξουαλικής διαφοροποίησης σαν μια μάχη επικράτησης ανάμεσα στις αρσενικές και θηλυκές ιεραρχίες-μονοπάτια, τότε το Dmrt1 είναι ένας εξελικτικά συντηρημένος “μοριακός-στρατιώτης” που στέκει στην πρώτη γραμμή της μάχης, μαχόμενος υπέρ της αρσενικής μεριάς σε σπονδυλωτά και ασπόνδυλα. Το γονίδιο αυτό βρέθηκε να υπερ-εκφράζεται στους όρχεις όλων των ειδών που εξετάσαμε. Σε συμφωνία με τα αποτελέσματα μας η χαρακτηριστική μεροληψία στην έκφραση του προς την αρσενική μεριά έχει αναφερθεί σε πολλούς άλλους γονοχωριστικούς ιχθύες (στην τιλάπια Oreochromis niloticus, στην ιριδίζουσα πέστροφα Oncorhynchus mykiss, στο οξύρυγχο της Σιβηρίας Acipenser baerii και στο Odontesthes bonariensis) καθώς και πολλούς ερμαφρόδιτους (στο πρώτανδρο Acanthopagrus schlegeli, στο πρώτανδρο ψάρι κλόουν Amphiphrion bicinctus, στο πρωτόγυνο Thalassoma bifasciatum, καθώς και σε διάφορα είδη πρωτόγυνων ροφών). Συμπεραίνουμε λοιπόν, πως ο ρόλος του Dmrt1 ως ρυθμιστή της αρσενικής ανάπτυξης φαίνεται να είναι συντηρημένος όχι μόνο στον γονοχωρισμό αλλά και στους διάφορους τύπους ερμαφροδιτισμού. Δρώντας ως μεταγραφικός παράγοντας μέσω της χαρακτηριστικής περιοχής δέσμευσης με το DNA (DM domain), όχι μόνο ενισχύει και προωθεί την αρσενική ανάπτυξη επάγοντας γονίδια του αρσενικού μονοπατιού, αλλά επίσης σταθεροποιεί και διατηρεί την αρσενική ταυτότητα της γονάδας μπλοκάροντας παράλληλα πολλά θηλυκά γονίδια. Τα στοιχεία δείχνουν ότι ακόμα και στα θηλαστικά, η απόφαση για την μοίρα της γονάδας δεν είναι οριστική, αλλά πρέπει ενεργά να διατηρείται σε όλη την διάρκεια της ζωής. Και εκεί, ο ρόλος του Dmrt1 είναι διαρκώς να μπλοκάρει την θηλυκή ανάπτυξη και έτσι να διατηρεί τον αρσενικό χαρακτήρα της γονάδας. Στο είδος γλώσσας Cynoglossus semilaevis, το Dmrt1 φαίνεται να είναι ένα γονίδιο που αλληλεπιδρά με το περιβάλλον εμπλέκεται σε επιγενετικούς μηχανισμούς μεθυλίωσης, και ενεργοποιεί τον μηχανισμό αναστροφής φύλου.Αυτά τα χαρακτηριστικά κάνουν το Dmrt1 έναν πρωταγωνιστή σε “ευέλικτους” αναπαραγωγικούς μηχανισμούς, όπως στην περίπτωση των σπαροειδών. Συνεπώς, το Dmrt1 μαζί με το Sox9 μάλλον διαδραματίζουν θεμελιώδη ρόλο στην έκφραση και τη διατήρηση του αρσενικού χαρακτήρα της γονάδας σε αυτή την οικογένεια ιχθύων. Στο αντίθετο «στρατόπεδο» βρίσκεται το άλλο μέλος της οικογένειας μεταγραφικών παραγόντων Dmrt, το Dmrt2. To γονίδιο αυτό εκφράστηκε στις θηλυκές γονάδες όλων των ειδών, αποτελέσματα που συμφωνούν με το πρότυπο έκφρασης του στον μπακαλιάρο, Gadus morhua και σε τέσσερα είδη κιχλίδων.Ο εκκινητής του γονιδίου της αρωματάσης έχει θέσεις πρόσδεσης για δύο πρωτεΐνες: Wilms tumor 1 protein (Wt1) και fushi tarazu factor-1 (Ftz-F1) ή steroidogenic factor-1 (Sf-1). Στα θηλαστικά υπάρχει μόνο ένα γονίδιο Wt1, κρίσιμο για την ανάπτυξη του ουροποιητικού συστήματος, ενώ στα ψάρια έχουν βρεθεί δύο Wt1 (Wt1a, Wt1b) που και τα δύο έχει αναφερθεί να εκφράζονται στις ωοθήκες. Το Sf1 έχει προταθεί ότι ελέγχει την έκφραση της αρωματάσης μαζί με κάποιος επιπλέον παράγοντας όπως το Foxl2 και το cAMP. Στην παρούσα μελέτη, και τα δύο γονίδια εμφανίζουν το ίδιο πρότυπο έκφρασης, υπερ-έκφραση στα θηλυκά των πρωτόγυνων ειδών, υπερ-έκφραση στα αρσενικά του στοιχειώδους ερμαφρόδιτου και του πρώτανδρου και ουδέτερη έκφραση στην γονοχωριστική συναγρίδα. Είναι πλέον προφανές ότι το περιβάλλον μπορεί να επηρεάσει τη δομή της χρωματίνης και την προσπελασιμότητα του DNA χωρίς να προκαλεί αλλαγές στα νουκλεοτίδια. Με επιγενετικές τροποποιήσεις των ιστονών, το περιβάλλον μπορεί επίσης να επηρεάσει τη γονιδιακή ρύθμιση και τελικά να τροποποιήσει τον φαινότυπο. Γονίδια επιγενετικών παραγόντων: DNA methyltransferases (Dnmt3aa, Dnmt1, Dnmt3ab), histone acetyl transferases (Ep300a, Kat2b), histone deacetylases (Hdac2, Hdac8, Hdac10, Hdac11) βρέθηκαν στο μεταγράφωμα όλων των ειδών που εξετάσαμε και παρουσιάζουν “sex-biased” έκφραση. Επίσης η ανάλυση εμπλουτισμού αποκάλυψε πληθώρα τέτοιων επιγενετικών παραγόντων, ενισχύοντας την άποψη ότι εμπλέκονται στον μηχανισμό φυλοκαθορισμού και διαφοροποίησης, καθώς και στην διατήρηση/σταθεροποίηση του φύλου. Η σχέση των επιγενετικών μηχανισμών με τον προσδιορισμό / διαφοροποίηση του φύλου τουλάχιστον στα σπονδυλωτά έχει επισημανθεί επανειλημμένως και αυτοί οι μηχανισμοί θεωρείται ότι αποτελούν τον συνδετικό κρίκο ανάμεσα στην περιβαλλοντικά ελεγχόμενη γονιδιακή έκφραση και την αναστροφή του φύλου. Τέλος, άλλοι τύποι επιγενετικών “σημαδιών” εκτός της μεθυλίωσης, όπως το microRNA και τα μικρά non-coding RNAs κατά τον φυλοκαθορισμό και την διαφοροποίηση του φύλου μόλις αρχίζουν να αναλύονται. Παρά τα τόσα διαφορετικά μοτίβα αναπαραγωγής και φυλοκαθορισμού στα ψάρια, υπάρχουν κάποια στοιχεία που υποδηλώνουν ότι η “γενετική εργαλειοθήκη” του φυλοκαθορισμού είναι σε κάποιο βαθμό συντηρημένη, με κάποιους “βασικούς” παράγοντες -“γονίδια” να συναντώνται κατ’ επανάληψη μεταξύ των ψαριών αλλά και ευρύτερα σε όλα τα σπονδυλωτά. Προκειμένου να ληφθεί υπόψη η παρατηρούμενη “συντήρηση” της μοριακής εργαλειοθήκης που χρησιμοποιείται στον φυλοκαθορισμό, αλλά και να εξηγηθεί συνάμα η εξελικτική ευελιξία του συστήματος, διαμορφώθηκαν κάποια πρώτα μοντέλα.Μια πρώιμη θεωρητική προσέγγιση που εκφράστηκε από τον Wilkins το 1995, είναι ότι οι γενετικές ιεραρχίες εξελίσσονται με έναν “bottom -up” τρόπο, δηλαδή από κάτω προς τα πάνω. Το οποίο επαναδιατυπώθηκε ως “masters change, but slaves remain” ή “the ephemeral dictators”. Αυτά τα θεωρητικά μοντέλα προσπάθησαν να εξηγήσουν την παρατήρηση ότι τα “master gene” δηλ. O κεντρικός “ρυθμιστής” είναι διαφορετικός σχεδόν σε όλα τα συστήματα φυλοκαθορισμού που έχουν μελετηθεί έως σήμερα. Αντιθέτως, γονίδια πιο κάτω στην υποτιθέμενη πυραμίδα αρχικά είχαν θεωρηθεί ότι είναι πιο συντηρημένα και ότι έχουν κρατήσει την θέση τους και τον ρόλο τους σε μεγαλύτερες εξελικτικές περιόδους. Κάποια από τα πιο διακεκριμένα παραδείγματα τέτοιων γονιδίων αποτελούν το Dmrt1, το Sox9 για τον σχηματισμό των όρχεων και η Cyp19a1 και το Wnt4 για την ανάπτυξη ωοθηκών, όπως τα ξέρουμε από τα θηλαστικά. Σε αυτή την λίστα θα μπορούσαν να προστεθούν ίσως και γονίδια όπως το Figla, Gdf9, Ctnnb1, and Foxl2 που συζητήθηκαν στην παρούσα μελέτη. Αν και πολλά από τα ίδια γονίδια εκφράζονται κατά την διαφοροποίηση της γονάδας στα πτηνά, στα ποντίκια στις χελώνες και ψάρια κτλπ, δεν υπάρχει κάποια κοινή ιεραρχία στην έκφραση των downstream μονοπατιών, ούτε έχει αποδειχθεί ότι υπάρχει μια συντηρημένη downstream “κασέτα” γονιδίων. Όπως και τα πιο upstream στοιχεία σε αυτή την “κασέτα”, έτσι και τα πιο downstream στοιχεία δεν είναι τόσο συντηρημένα όπως αρχικά είχε υποτεθεί. Ο ρόλος και η θέση κάθε στοιχείου δεν παραμένει ίδιος και μπορεί να αλλάζει μεταξύ διαφορετικών ειδών και στα διάφορα συστήματα φυλοκαθορισμού. Ακόμα και σε συστήματα που υπάρχει ένας κυρίαρχος “κεντρικός ρυθμιστής”, γενετικά πειράματα έχουν δείξει ότι ένα πιο downstream γονίδιο (ένα γονίδιο χαμηλότερα στην ιεραρχία) μπορεί να αντικαταστήσει τον πιο πάνω κεντρικό ρυθμιστή. Αυτά τα γενετικά πειράματα δείχνουν ότι υπάρχουν πολλαπλά σημεία λειτουργικού ελέγχου (functional entry points) ακόμα και στα πλέον σταθερά συστήματα φυλοκαθορισμού των θηλαστικών.Έτσι, τα πιο πρόσφατα μοντέλα προτείνουν ότι το φύλο θα μπορούσε να ερμηνευτεί ως ένας φαινότυπος «ουδούς» με εναύσματα (γενετικά, επιγενετικά και περιβαλλοντικά) να ενεργούν σε ένα σύμπλεγμα αλληλεπιδρώντων γονιδιακών δικτύων και ορμονών, με αποτέλεσμα μια πολύ σύνθετη αλληλεπίδραση μεταξύ διαφορετικών σημάτων.Η γνώση που αποκτήθηκε με αυτή την διατριβή καθως και τα εργαλεία που αναπτύχθηκαν κατά τη διάρκεια αυτής, θέτουν τις βάσεις για μελλοντικά πειράματα που θα δώσουν λύσεις στην υδατοκαλλιέργεια για τον έλεγχο του φύλου σε αυτά τα είδη. Η παρούσα μελέτη έδειξε ότι αν κάποιος θέλει να μελετήσει φυλετικό διμορφισμό στον εγκέφαλο, θα έπρεπε στοχεύσει σε συγκεκριμένες περιοχές αυτού, όπως περιοχές που συνδέονται με τον άξονα Υποθαλαμου -υποφυσης-γονάδων (HPG axis) και περιοχές που είναι υπεύθυνες για κοινωνικές συμπεριφορές και μηνύματα κατά το ζευγάρωμα. Η μελέτη αυτή επίσης συμβάλει στην εις βάθος κατανόηση του πολύπλοκου μηχανισμού διαφοροποίησης του φύλου, σε πιο ευέλικτα και ίσως πολυπαραγοντικά συστήματα όπως αυτά των οργανισμών μελέτης. Χρησιμοποιώντας την παραχθείσα γνώση από αυτό το διδακτορικό, η μελλοντική έρευνα μπορεί να κατευθυνθεί σε αρκετά παρεμφερή αντικείμενα: -Μπορεί κανείς να μελετήσει τις διαφορές στην έκφραση των συγκεκριμένων γονιδίων που αναδείξαμε, σε διαφορετικά στάδια διαφοροποίησης της γονάδας. -Μπορεί να μελετήσει τους κοινωνικούς/συμπεριφορικούς/περιβαλλοντικους παράγοντες που επηρεάζουν και δίνουν το έναυσμα για την αναστροφή του φύλου-Μπορεί κανείς να στοχεύσει και να σιγήσει τα γονίδια που αναδείξαμε με RNAi, gene knock-down and/or CRISPR/Cas9. -Μπορεί να μελετηθεί το μεθυλίωμα. Θα ήταν ίσως ενδιαφέρον να μελετηθούν οι επιγενετικοί παράγοντες που εμπλέκονται στην έκφραση των συγκεκριμένων γονιδίων με Chipseq. -Μπορεί κανείς να συγκρίνει τους εξελικτικούς ρυθμούς των sex-biased και των un-biased γονιδίων. Καθως και των male-biased vs female-biased. Έχοντας πρόσφατα επιλύσει την φυλογενετική σχέση μεταξύ των ειδών, θα είμαστε σύντομα σε θέση να συγκρίνουμε την φυλο-εξαρτώμενη έκφραση αυτών των οργανισμών υπο το εξελικτικό πρίσμα.