Διαφοροποίηση μονοκυττάρων προς ενδοθηλιακά κύτταρα: καλλιέργεια σε σταθερά υποστρώματα

Abstract

As our population ages and life expectancy increases there is a great need for research in the field of regenerative medicine. Stem cell and biomaterial treatments are an important part of the above industry, which has been growing rapidly in recent years and is referred to the treatment of degenerative diseases. The goal is to find the best combination of biomaterials and cells for the regeneration of the affected tissues. In recent years a new cell line has been isolated from peripheral blood, which has the potential to differentiate into multiple new cell lines that may have applications in regenerative medicine. These cells are called pluripotent cells of monocytic origin (MOMCs). MOMCs are a cell population, with fibroblast morphology, and a unique phenotype positive for the CD14, CD45 and CD34 markers.MOMCs have the capacity to differentiate into a variety of mesenchymal cell types including osteocytes, chondrocytes, adipocytes, cardiomyocytes, skeletal myocytes endothelial and pro-endothelial cells. Endothelial cells cover the lumen of the vessels, contribute to the normal blood flow, and in the form of pro-endothelial cells they create vessels in ischemic regions, ensuring oxygenation and survival of the organs. Their combination with scaffolds induces differentiation, long stay and regenerative activity in the affected areas. In this study nanoprecipitated polycaprolactone (PCL) films were coated with endothelial cells generated by MOMCs. The combination of these cells and scaffolds is presented for the first time in the literature.Nanofibres were enriched by the spin coating process with various additives such as silicon nanotubes (SiO2 ntbs), strontium nanoparticles, nanohydroxyapatite (SrHA) nanoparticles, nanofibers nanoparticles (nHAp nrds) and strontium-reinforced nanoparticles nanoparticles (SrnBG) to enhance cellular differentiation and to reduce cytotoxicity. Mononuclear cells derived from peripheral blood of healthy donors were isolated and then incubated in poly-L-lysine and gelatin coated plates in the presence of the chemotactic factor SDF-1a, which is known to induce proliferation of MOMCs. Wharton’s Jelly mesenchymal cells (WJSCs) were used as a control cell line. MOMCs and WJSCs were genetically modified via the Sleeping Beauty Transposon System aiming their fluorescence onto the scaffolds. To avoid MOMCs exhaustion in culture, for the induction of differentiation towards endothelium, Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC) were used to strengthen and accelerate the procedure in semi-permeable culture systems. The induced ability to differentiate MOMCs to endothelial was assessed by flow cytometry, while comparison of gene expression levels associated with proliferation and differentiation was performed by real time PCR. The cells were observed with the Scanning Electron Microscope (SEM) and the cytotoxicity of the materials was tested by the MTT method.The results show that MOMCs, when differentiated on non-cytotoxic materials, especially on silicon nanotubes (SiO2 ntbs) enriched with silicon nanotubes (PCBs), gradually lose their original markers and acquire endothelial markers both in expression and transcription levels. In addition, cell morphology confirms their differentiation.Peripheral blood is an immediate and ever available source of MOMCs that can be harvested by standard and easy procedure. MOMCs in combination with PCL nanoscale nanoparticles could contribute to the coating of stents for faster endothelial repair of occluded arteries as well as angiogenesis of areas with arterial occlusion, better oxygenation and to improve the function of ischemic organs

Καθώς ηλικιακά ο παγκόσμιος πληθυσμός μεγαλώνει και το προσδόκιμο ζωής αυξάνεται, υπάρχει μεγάλη ανάγκη για έρευνα στον τομέα της αναγεννητικής ιατρικής. Οι θεραπείες με βάση τα βλαστοκύτταρα και τα βιοϋλικά αποτελούν σημαντικό κομμάτι του παραπάνω κλάδου, το οποίο αναπτύσσεται ραγδαία τα τελευταία χρόνια και αφορά την αντιμετώπιση των νοσημάτων φθοράς. Στόχος είναι να βρεθεί ο καλύτερος συνδυασμός βιοϋλικών και κυττάρων για την αναγέννηση του πάσχοντα ιστού. Τα τελευταία χρόνια μια νέα κυτταρική σειρά απομονώθηκε από το περιφερικό αίμα, η οποία έχει τη δυνατότητα διαφοροποίησης σε πολλαπλές νέες κυτταρικές σειρές οι οποίες μπορούν να έχουν εφαρμογές στην αναγεννητική ιατρική. Τα κύτταρα αυτά ονομάζονται πολυδύναμα κύτταρα μονοκυτταρικής προέλευσης (MOMCs). Τα MOMCs είναι ένας κυτταρικός πληθυσμός με μορφολογία ινοβλάστη και μοναδικό φαινότυπο θετικό για τους δείκτες CD14, CD45 και CD34. Τα MOMCs έχουν την ικανότητα να διαφοροποιούνται in vitro σε πολλούς κυτταρικούς τύπους συμπεριλαμβανομένων των οστικών, χονδροκυττάρων, λιποκυττάρων, σκελετικών, καρδιακών, προενδοθηλιακών και ενδοθηλιακών κυττάρων. Τα ενδοθηλιακά κύτταρα καλύπτουν τον αυλό των αγγείων, συμβάλλουν τη φυσιολογική ροή του αίματος και με τη μορφή των προενδοθηλιακών κυττάρων δημιουργούν αγγειογένεση σε περιοχές ισχαιμίας, εξασφαλίζοντας την οξυγόνωση και επιβίωση των οργάνων. Ο συνδυασμός τους με ικριώματα εξασφαλίζει την διαφοροποίηση τους, την μακρόχρονη παραμονή και δράση τους στις πάσχουσες περιοχές. Στη μελέτη αυτή δημιουργήθηκαν νανοσύνθετα υμένια πολυκαπρολακτόνης (PCL) επικαλυμμένα με ενδοθηλιακά κύτταρα τα οποία δημιουργήθηκαν από τα MOMCs. Ο συνδυασμός των εν λόγω κυττάρων και ικριωμάτων παρουσιάζεται για πρώτη φορά στη βιβλιογραφία. Τα νανοϋμένια εμπλουτίστηκαν, με τη μέθοδο spin coating, με διάφορα πρόσθετα, όπως νανοσύνθετα υμένια PCL με νανοσωλήνες πυριτίου (SiO2 ntbs), νανοσωματίδια στροντίου, νανοϋδροξυαπατίτη (SrHA), νανοσωματίδια νανοϋδροξυαπατίτη (nHAp nrds) και νανοσωματίδια βιοενεργού γυαλιού ενισχυμένα με στρόντιο (SrnBG) ώστε να ενισχύσουν την κυτταρική διαφοροποίηση και να ελαττώσουν την κυτταροτοξικότητα. Mονοπύρηνα κύτταρα προερχόμενα από περιφερικό αίμα υγιών δοτών, απομονώθηκαν και ακολούθως επωάστηκαν σε πλάκες επικαλυμμένες με πολυ-L-λυσίνη και ζελατίνη παρουσία του χημειοτακτικού παράγοντα SDF-1a, ο οποίος είναι γνωστό ότι επάγει τον πολλαπλασιασμό MOMCs. Μεσεγχυματικά κύτταρα της ουσίας Wharton (WJSCs) χρησιμοποιήθηκαν ως κυτταρική σειρά ελέγχου. Τα MOMCs και WJSCs τροποποιήθηκαν γενετικά με στόχο τον φθορισμό τους στα ικριώματα με την χρήση του Sleeping Beauty. Προκειμένου να αποφευχθεί η εξάντληση των MOMCs στην καλλιέργεια και να επιταχυνθεί η διαδικασία της διαφοροποίησης προς ενδοθηλιακά, προστέθηκαν ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα ομφάλιας φλέβας (HUVEC) σε συγκαλλιέργεια με τη χρήση ημιδιαπερατού συστήματος καλλιέργειας. Η επαγόμενη ικανότητα διαφοροποίησης των MOMCs προς ενδοθηλιακά εκτιμήθηκε με κυτταρομετρία ροής, ενώ η σύγκριση των επιπέδων έκφρασης γονιδίων που σχετίζονται με τον πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση πραγματοποιήθηκε με real time PCR. Τα κύτταρα παρατηρήθηκαν με το ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης (SEM) και η κυτταροτοξικότητα των υλικών ελέγχθηκε με την μέθοδο ΜΤΤ. Τα αποτελέσματα δείχνουν ότι τα ΜΟΜCs κατά τη διαφοροποίηση τους πάνω σε μη κυτταροτοξικά υλικά, και ιδιαίτερα πάνω σε PCL υμένια εμπλουτισμένα με νανοσωλήνες πυριτίου (SiO2 ntbs), χάνουν σταδιακά τους βασικούς δείκτες τους και αποκτούν ενδοθηλιακούς δείκτες τόσο σε επίπεδο έκφρασης όσο και μεταγραφής. Επιπλέον, η μορφολογία των κυττάρων επιβεβαιώνει τη διαφοροποίησή τους. Το περιφερικό αίμα αποτελεί μια άμεσα και συνεχώς διαθέσιμη πηγή λήψης και αξιοποίησης των MOMCs με εύκολη λήψη. Τα MOMCs σε συνδυασμό με νανοσύνθετα με PCL υμένια θα μπορούσαν να συμβάλλουν στην επικάλυψη των stents για την ταχύτερη αποκατάσταση του ενδοθηλίου των αποφραγμένων αρτηριών, καθώς και στην αγγειογένεση περιοχών με αρτηριακή απόφραξη, στην καλύτερη οξυγόνωση τους και στη βελτίωση της λειτουργίας των ισχαιμούντων οργάνων.