Μοριακή χαρτογράφηση μικροβιακών κοινοτήτων υδάτινων οικοσυστημάτων της Ηπείρου και μελέτη αξιοποίησής τους ως πηγών πιθανών αντικαρκινικών παραγόντων

Abstract

Ancient ecosystems are hotspots of biodiversity and their longevity and geographical isolation make them important agents for evolutionary and climate history research. Many ancient lakes are found in Greece. One of them is lake Pamvotis which we studied. Lake Pamvotis is a shallow, eutrophic lake and to our knowledge this is the first study to reveal bacterial and archaeal diversity in lake Pamvotis. Subject of this study was also the isolation and culture of bacterial cells from lake Pamvotis. Methanol and aquatic extracts from those cultures would be evaluated for their potential cytotoxic and antineoplastic effects in cancer cell lines.We used water and sediment samples from lake Pamvotis from two stations and each season. Firstly, we determined the physicochemical parameters and then in order to reveal the diversity of bacteria and archaea we used extraction DNA protocol, PCR protocols, DGGE, cloning, sequencing, phylogenetic analysis tools and next generation sequencing. To quantify bacteria and archaea in lake Pamvotis samples, we used real-time PCR and we used BIOLOG method to study the bacterial biochemical profile. We also performed statistical analysis to investigate possible relationships among bacterial and archaeal abundances and the physicochemical variables. In case of bacterial and cyanobacterial cultures, we used R2A and BG11 medium, respectively. Methanol and aquatic extracts from isolated bacteria and cyanobacteria were tested in cancer cell lines A549, HepG2, MCF7 and MRC7 (control) for cytotoxic/antineoplastic activity. Concerning lake Pamvotis sediments, we identified many bacterial (50.88%) and archaeal (20.65%) sequences corresponding to potentially new species and most of the bacterial (84.21%) and archaeal (95.65%) sequences were found not to have cultivated counterparts (compared to GenBank entries). Proteobacteria, Cyanobacteria and methanogenic archaea were in abundance in the sediments of the lake and archaea represent 11.13%-23.88% of the total prokaryotic cells. Of the determined physicochemical variables, Ni,Cr,Ca,pH,TKN,As,TC were found to affect strongly the prokaryotic abundances. Upon phylogenetic analysis, a new class of Cyanobacteria was identified and named “Lake Pamvotis cluster” (LPC). In the water samples of lake Pamvotis we also identified bacterial sequences corresponding to potentially new species. Archaea represent 0.14%-9.77% of the total prokaryotic cells and we noticed that cyanobacteria related to Synechococcus sp. might be responsible for a bloom in spring, different than Microcystis sp. bloom in summer.Finally, the extracts from bacterial and cyanobacterial cultures which we used for toxicity tests, revealed a potential bioactive compound. The cyanobacterial methanol extract had cytotoxic effects (apoptosis) on MCF7 cells and on control fibroblasts (MRC5 cells). This extract was derived from the cyanobacterium related to Pseudanabaena/Limnothrix sp. and the bioactive compound was not belonging to known cyanotoxins.

Τα αρχαία οικοσυστήματα προσελκύουν το ενδιαφέρον των ερευνητών καθώς η παρατεταμένη ζωή τους και η γεωγραφική τους απομόνωση τα καθιστούν μοντέλα μελέτης εξέλιξης ειδών και περιβαλλοντικών αλλαγών. Πολλές αρχαίες λίμνες βρίσκονται στον ελλαδικό χώρο. Μια από αυτές είναι η λίμνη Παμβώτιδα την οποία και μελετήσαμε. Η λίμνη Παμβώτιδα είναι μια ρηχή, ευτροφική λίμνη, στην οποία δεν έχουν διεξαχθεί μελέτες προσδιορισμού της ποικιλότητας Βακτηρίων και Αρχαίων. Θέμα επίσης της παρούσας μελέτης αποτέλεσε η απομόνωση και η καλλιέργεια ετερότροφων Βακτηρίων και κυανοβακτηρίων από τη λίμνη και έπειτα η πραγματοποίηση δοκιμών κυτταροτοξικότητας μεθανολικών και υδατικών εκχυλισμάτων αυτών σε καρκινικές κυτταρικές σειρές. Χρησιμοποιήσαμε δείγματα νερού και ιλύος από τη λίμνη Παμβώτιδα από δυο σταθμούς, τις τέσσερις εποχές του έτους. Προσδιορίσαμε τις φυσικοχημικές παραμέτρους της ιλύος και του νερού και στη συνέχεια για να μελετήσουμε την ποικιλότητα Βακτηρίων/Αρχαίων προχωρήσαμε σε εκχύλιση DNA, PCR, πήκτωμα DGGE, κλωνοποίηση, αλληλούχιση, φυλογενετική ανάλυση και αλληλούχιση επόμενης γενιάς. Για την ποσοτικοποίηση των προκαρυωτικών κυττάρων στα δείγματα της λίμνης χρησιμοποιήσαμε real-time PCR. Με τη μέθοδο BIOLOG μελετήσαμε το βιοχημικό προφίλ των Βακτηρίων. Εφαρμόσαμε στατιστική ανάλυση θέλοντας να διαπιστώσουμε αν υπάρχει συσχέτιση των φυσικοχημικών παραμέτρων με την αφθονία Βακτηρίων και Αρχαίων. Στην περίπτωση των βακτηριακών καλλιεργειών, χρησιμοποιήσαμε θρεπτικά μέσα R2A και BG11 για την ανάπτυξη και απομόνωση ετερότροφων Βακτηρίων και κυανοβακτηρίων, αντίστοιχα. Πρωτόκολλα εκχύλισης σε μεθανόλη και νερό χρησιμοποιήθηκαν για την απομόνωση των βακτηριακών εκχυλισμάτων, τα οποία χρησιμοποιήθηκαν για δοκιμές τοξικότητας σε καρκινικές κυτταρικές σειρές (A549, HepG2, MCF7) και σε φυσιολογικούς ινοβλάστες (MRC5). Στην παρούσα εργασία ανιχνεύσαμε μεγάλο ποσοστό Βακτηρίων (50.88%) και Αρχαίων (20.65%) στα δείγματα ιλύος της λίμνης Παμβώτιδας που ανήκουν σε νέα είδη/στελέχη και ακόμη μεγαλύτερα ποσοστά (84.21%, 95.65% αντίστοιχα) που ανήκουν σε μη καλλιεργούμενα είδη με βάση εισαγωγές στη βάση δεδομένων GenBank. Στα ιζήματα της λίμνης κυριαρχούν Proteobacteria, Cyanobacteria και μεθανογόνα Αρχαία. Επίσης, τα Αρχαία καταλαμβάνουν το 11.13%-23.88% του συνολικού αριθμού των προκαρυωτικών κυττάρων, ενώ τα φυσικοχημικά χαρακτηριστικά που επηρεάζουν την αφθονία των προκαρυωτικών κυττάρων είναι τα Ni,Cr,Ca,pH,TKN,As,TC. Επιπλέον, ανιχνεύσαμε αλληλουχίες κυανοβακτηρίων οι οποίες διαπιστώσαμε πως σχηματίζουν μια φυλογενετικά ξεχωριστή ομάδα η οποία ονομάστηκε “Lake Pamvotis cluster”. Στο νερό της λίμνης ανιχνεύσαμε αλληλουχίες Βακτηρίων που ανήκουν σε νέα είδη/στελέχη. Τα Αρχαία καταλαμβάνουν το 0.14%-9.77% της μικροβιακής κοινότητας και για πρώτη φορά διαπιστώσαμε πως κυανοβακτήρια του γένους Synechococcus sp. πιθανόν δημιουργούν μια άνθιση την άνοιξη, διαφορετική από εκείνη του καλοκαιριού (Microcystis sp.).Στη συνέχεια, απομονώσαμε και καλλιεργήσαμε ετερότροφα Βακτήρια και κυανοβακτήρια, εκχυλίσματα των οποίων χρησιμοποιήσαμε σε δοκιμές τοξικότητες στις καρκινικές κυτταρικές σειρές. Ένα μεθανολικό εκχύλισμα από κυανοβακτήριο διαπιστώσαμε πως προκαλεί έντονα φαινόμενα απόπτωσης σε κύτταρα καρκίνου μαστού (MCF7) αλλά και στους φυσιολογικούς ινοβλάστες (MRC5). Το κυανοβακτήριο αυτό το οποίο χαρακτηρίσαμε μοριακά, ανήκει στο γένος Pseudanabaena/Limnothrix sp. και ο βιοδραστικός παράγοντας που παράγει δεν ανήκει στις γνωστές κυανοτοξίνες.