Επιδημιολογική και μοριακή μελέτη λοιμώξεων από Staphylococcus aureus στα παιδιά

Abstract

Objectives: Staphylococcus aureus (SA) is a well-established multidrug resistant pathogen, whereas community-acquired methicillin-resistant S. aureus (CA-MRSA) infections in children are of major concern. The purpose of this study was to assess the epidemiology, clinical characteristics, antimicrobial resistance patterns and molecular markers of certain S. aureus infections occurred in Greek children with no healthcare risk factors attending a large pediatric hospital in Athens during a ten-year period. CA-MRSA infections (2007-2016), skin and soft tissue infections (SSTIs) caused by mupirocin-resistant-methicillin-susceptible S. aureus strains (2013-2016) and CA-SA pneumonia cases (2007-2014) have been reviewed and studied. Methods: Cases and resistance patterns of all S. aureus isolates recovered from outpatients and inpatients were reviewed using the laboratory (LIS) and WHONET software. Medical files were reviewed where judged necessary and epidemiological categorization of infections as CA or HA was assigned. Cultures were performed according to the procedures of the microbiological laboratory. Identification of S. aureus was done by conventional methods (colony morphology, catalase test, latex agglutination test). Antimicrobial susceptibility testing was performed by disk diffusion method according the CLSI guidelines. For cefoxitin ambiguous results the latex PBP2a Slidex MRSA Detection Kit (bioMerieux SA, France) was used. A disk approximation test (D test) was used to detect inducible clindamycin resistance. Vancomycin, teicoplanin, linezolid MICs for invasive strains were determined by a gradient MIC method. Genes encoding high level (HLR) mupirocin resistance (mupA), fusidic acid resistance (fusB), ermA, ermC, PVL (lukS/lukF-PV), exfoliative toxins (eta, etb), fibronectin binding protein A (fnbA) were investigated in preserved selected strains by PCRs. Genotyping was performed by SCCmec and agr typing, whereas clonality was determined by PFGE and MLST.Results: During 2007-2016, 5423 CA-SA infections were recorded. Of these, 119 were invasive, osteoarticular infections were predominant (66, 55.5%), followed by bacteremia (25, 21%) and pneumonia (22, 18.5%). MRSA were 41.2% of invasive infections, strongly associated with pneumonia cases (86.4%, p<0.01). Overall, MRSA declined yearly from 37.3% (2008) to 15.7% (2016). SSTIs accounted for 85.2% of the above MRSA infections. Concurrent resistance to fusidic acid, kanamycin and tetracycline was high (>50%), for erythromycin was 20% (9.45 – 34.9) and for clindamycin 17.8% (8.7 – 33.3). A total of 437 cases of mupirocin-resistant S. aureus were recorded for 2013-2016. All but 3 isolates were methicillin-susceptible. Impetigo was the predominant clinical entity (371, 84.9%) followed by staphylococcal skin scalded syndrome (21, 4.8%) wheras no abscesses were identified. The number of infections detected annually increased during the study years, especially during the summer months. The percentage of high-level-resistance to mupirocin and constitutive resistance to clindamycin were 99% and 20.1%, respectively. Among 102 representative strains available for molecular investigation, 100 (98%) were mupA- and 97 (95%) fusB-positive, 26/27 (96.3%) clindamycin-resistant strains were ermC-positive, 83 (81.4%) lukS/lukF-positive, 95 (93%) carried both eta/etb genes, 99 (97%) were fnbA-positive. Genotyping of MSSA strains revealed that 96/99 (96.7%) belonged to one main pulsotype 1 classified as ST121. During 2007-2014, 41 cases of CA-SA pneumonia were recorded (boys, 61%); median age 4.3 months from both pediatric hospitals “P. & A. Kyriakou” and “Aghia Sophia”. MRSA accounted for 31 cases (75.6%). Complications included empyema (25/41, 61%), pneumatoceles (7/41, 17%) and lung abscess (1/41, 2.5%). Intensive Care Unit admission was required in 58.5%. Two deaths occurred (4.9%). Definitive therapy was based on vancomycin with or without other antibiotics (55.9%), followed by clindamycin and linezolid (26.5% each). All isolates were susceptible to vancomycin (MIC90 2mg/l, range 1-2), teicoplanin (MIC90 1.5mg/l, range 0.5-2) and linezolid (MIC90 1mg/l range 0.25-2), whereas 26.8% were resistant to clindamycin. Among 25 studied strains, 20 were mecA-positive, carrying also the fnbA gene. Of these, 90% belonged to ST80-IV/agrIII/lukS/lukF - positive clone. MSSA strains showed polyclonality, 3/5 were lukS/lukF positive and 3/5 fnbA-positive.Conclusions: CA-MRSA infections have significantly declined among children over the last decade. Resistance to fusidic acid, kanamycin and tetracycline being a phenotypical marker of European ST80 is high among these strains but declines over time too. The spectrum of CA-MRSA infections in children in our area is largely associated with the spread of ST80 clone and their clinical characteristics are similar to those described in other parts of the world where different MRSA clones predominate.Moreover, a newly emerged MSSA clone (ST121) carrying genes for resistance to topical antimicrobials and epidermolysins, causing mainly impetigo was documented. Resistance and rich toxinogenic profile confers to this clone adaptability for spread in the community. SSSS cases were also on the rise due to the aforementioned clone. Pediatricians must be discouraged overprescribing topical antimicrobials in their practice.MRSA and particularly ST80-IV clone predominated among pediatric CA-SA pneumonia cases. Treatment provided was effective in all but two patients, despite relatively high MIC values of vancomycin and a high resistance rate to clindamycin.

Σκοπός: Ο Staphylococcus aureus (SA) είναι μείζον βακτηριακό παθογόνο, συχνά ανθεκτικό σε διάφορα αντιμικροβιακά και προκαλεί σημαντική νοσηρότητα αλλά και θνησιμότητα στην κοινότητα και το νοσοκομείο. Οι σταφυλοκοκκικές λοιμώξεις της κοινότητας από ανθεκτικό στη μεθικιλλίνη SA (community-associated methicillin resistant Staphylococcus aureus, CA-MRSA) είναι αρκετά συχνές στα παιδιά στην περιοχή μας. Σκοπός της παρούσας διατριβής είναι η επιδημιολογική, κλινική και μικροβιολογική διερεύνηση των σταφυλοκοκκικών λοιμώξεων της κοινότητας και η μοριακή μελέτη των στελεχών που απομονώθηκαν στο Νοσοκομείο Παίδων «Π. & Α. Κυριακού» κατά την δεκαετία 2007-2016. Αναλυτικά, μελετήθηκαν οι λοιμώξεις της κοινότητας από MRSA (CA-MRSA), οι λοιμώξεις από ανθεκτικό στη μουπιροκίνη - ευαίσθητο στη μεθικιλλίνη SA (2013-2016) και οι περιπτώσεις σταφυλοκοκκικής πνευμονίας της κοινότητας (2007-2014). Υλικό και Μέθοδοι: Καταγράφηκαν αναδρομικά μέχρι το 2012 και προοπτικά στη συνέχεια, όλες οι λοιμώξεις από S. aureus εξωνοσοκομειακών και νοσηλευόμενων ασθενών και κατηγοριοποιήθηκαν σε λοιμώξεις κοινότητας (community-associated, CA) και νοσοκομειακές (health care-associated, HA). H καταγραφή των ασθενών βασίσθηκε στα αρχεία του Μικροβιολογικού Εργαστηρίου του Νοσοκομείου Παίδων «Π. και Α. Κυριακού». Για τη μελέτη της πνευμονίας έγινε ανασκόπηση και των αρχείων του Μικροβιολογικού Εργαστηρίου του Νοσοκ. Παίδων «η Αγία Σοφία» καθώς και ανάλυση των αντιστοίχων στελεχών σταφυλοκόκκου. Οι καλλιέργειες των κλινικών δειγμάτων έγιναν σύμφωνα με τις μεθόδους του Μικροβιολογικού Εργαστηρίου, η ταυτοποίηση του μικροβίου με συμβατικές μεθόδους και ο έλεγχος ευαισθησίας στα αντιμικροβιακά φάρμακα έγινε σύμφωνα με τις οδηγίες του CLSI. Για αμφίβολα αποτελέσματα στην κεφοξιτίνη χρησιμοποιήθηκε το latex PBP2a Slidex MRSA Detection Kit (bioMerieux SA, France), και το D-test για τον προσδιορισμό του τύπου της αντοχής στην κλινδαμυκίνη. Στα διεισδυτικά στελέχη έγινε προσδιορισμός των MICs των αντιμικροβιακών βανκομυκίνη, τεϊκοπλανίνη και λινεζολίδη με ταινίες διαβαθμισμένης συγκέντρωσης. Μοριακή μελέτη με PCRs έγινε σε επιλεγμένα στελέχη για την ανίχνευση γονιδίων αντοχής στη μουπιροκίνη (mupA), το φουσιδικό οξύ (fusB) και την κλινδαμυκίνη (ermA, ermC), αλλά γονιδίων που κωδικοποιούν λοιμογόνους παράγοντες, όπως PVL (lukS/lukF-PV), επιδερμολυσίνες (eta, etb), fibronectin binding protein A (fnbA). Γονοτυπικές μέθοδοι (SCCmec και agr τυποποίηση), ηλεκτροφόρηση σε εναλλασσόμενο πεδίο (PFGE) και πολυτοπική ανάλυση αλληλουχιών (MLST) εφαρμόστηκαν για τον χαρακτηρισμό των κλώνων.Αποτελέσματα: Γενικά. Κατά το χρονικό διάστημα 2007-2016, καταγράφηκαν 5.423 περιστατικά σταφυλοκοκκικκών λοιμώξεων της κοινότητας (CA-SΑ). Η πλειονότητα των περιπτώσεων αφορούσε λοιμώξεις δέρματος και μαλακών μορίων (85.2%). Μεταξύ των 119 περιπτώσεων διεισδυτικής σταφυλοκοκκικής λοίμωξης, συχνότερες ήταν οι οι οστεοαρθρικές (ν=66, 55.5%) λοιμώξεις ακολουθούμενες από τις μικροβιαιμίες (25, 21%) και τις πνευμονίες (22, 18.5%). Ανθεκτικός στη μεθικιλλίνη σταφυλόκοκκος (MRSA) ήταν το αίτιο σε ποσοστό 41,2% του συνόλου των περιπτώσεων διεισδυτικής λοίμωξης και ήταν σημαντικά συχνότερος μεταξύ των περιπτώσεων πνευμονίας (86.4%, p<0.01). Συνολικά, η επίπτωση του MRSA ελαττώθηκε με την πάροδο των ετών από 37.3% (2008) σε 15.7% (2016). H συχνότητα αντοχής των ως άνω στελεχών MRSA σε καναμυκίνη, τετρακυκλίνη και φουσιδικό οξύ ήταν υψηλή (>50%), στην ερυθρομυκίνη 20% (9.45 – 34.9) και στην κλινδαμυκίνη 17.8% (8.7 – 33.3). Λοιμώξεις από ανθεκτικά στη μουπιροκίνη στελέχη σταφυλοκόκκου. Συνολικά, καταγράφηκαν 437 περιπτώσεις λοιμώξεων από ανθεκτικό στη μουπιροκίνη SA κατά την χρονική περίοδο 2013-2016. Όλα τα ως άνω στελέχη πλην τριών ήταν ευαίσθητα στη μεθικιλλίνη. Το μολυσματικό κηρίο ήταν η συχνότερη κλινική οντότητα (371, 84.9%), και δεύτερο σε συχνότητα το σταφυλοκοκκικό σύνδρομο δερματικής αποφολίδωσης (staphylococcal scalded skin syndrome, SSSS) (21, 4.8%), ενώ δεν διαπιστώθηκε περιστατικό αποστήματος οφειλόμενου στο στέλεχος αυτό. Οι λοιμώξεις από ανθεκτικό στη μουπιροκίνη SA παρουσίασαν αυξητική τάση κάθε έτος και ήταν συχνότερες κατά τους θερινούς μήνες. Αντοχή υψηλού επιπέδου στη μουπιροκίνη διαπιστώθηκε στο 99% και ιδιοσυστασιακή αντοχή στην κλινδαμυκίνη στο 20.1% των στελεχών. Μοριακή διερεύνηση διενεργήθηκε σε 102 αντιπροσωπευτικά στελέχη και εξ αυτών 100 (98%) ήταν mupA- και 97 (95%) fusB-θετικά, 83 (81.4%) lukS/lukF-θετικά, 95 (93%) eta/etb-θετικά συγχρόνως, και 99 (97%) fnbA-θετικά. 26/27 (96.3%) των ανθεκτικών στην κλινδαμυκίνη ήταν ermC-θετικά Γονοτυπικός έλεγχος των στελεχών με PFGE έδειξε ότι 96/99 (96.7%) στελέχη ανήκαν στον κύριο PFGE τύπο 1, ενώ ο έλεγχος με MLST σε τυχαία επιλεγμένα από κάθε τύπο στελεχη έδειξε ότι όλα ανήκαν στον ST121 κλώνο.Σταφυλοκοκκικές πνευμονίες. Κατά την περίοδο 2007-201 καταγράφηκαν 41 περιπτώσεις CA-SA πνευμονίας σε παιδιά (αγόρια 61%, διάμεσης ηλικίας 4.3 μηνών, IQR 2.8-28 μήνες) που νοσηλεύτηκαν στα δύο Παιδιατρικά Νοσοκομεία «Π. & Α. Κυριακού» και «Η Αγία Σοφία». MRSA απομονώθηκε σε 31 περιπτώσεις (75.6%). Οι συχνότερες επιπλοκές ήταν το εμπύημα (25/41, 61%), οι πνευματοκήλες (7/41, 17%) και το πνευμονικό απόστημα (1/41, 2.5%). Εισαγωγή στη Μονάδα Εντατικής Θεραπείας απαιτήθηκε σε 24 (58.5%) περιπτώσεις, ενώ δύο ασθενείς κατέληξαν (4.9%). Ως οριστική θεραπεία χορηγήθηκε βανκομυκίνη με ή χωρίς την προσθήκη άλλου αντιμικροβιακού (55.9%), κλινδαμυκίνη και λινεζολίδη (26.5% έκαστη). Όλα τα στελέχη ήταν ευαίσθητα στην βανκομυκίνη (MIC90 2mg/l, εύρος 1-2), τεϊκοπλανίνη (MIC90 1.5mg/l, εύρος 0.5-2) και λινεζολίδη (MIC90 1mg/l εύρος 0.25-2), ενώ 26.8% ήταν ανθεκτικά στην κλινδαμυκίνη. Μεταξύ των 25 μοριακά μελετηθέντων στελεχών, 20 ήταν mecA-θετικά και fnbA-θετικά. Από αυτά, 90% ανήκαν στον ST80-IV/agrIII/lukS/lukF-θετικό κλώνο. Τα MSSA στελέχη ήταν πολυκλωνικά, 3/5 ήταν lukS/lukF-θετικά και 3/5 fnbA-θετικά.Συμπεράσματα: Οι CA-MRSA λοιμώξεις μειώθηκαν στα παιδιά κατά την δεκαετία 2007-2016. Η συχνότητα της συνδυασμένης αντοχής στα αντιβιοτικά φουσιδικό οξύ, τετρακυκλίνη και καναμυκίνη που χρησιμοποιείται ως φαινοτυπικός δείκτης του Ευρωπαϊκού-ST-80-IV κλώνου μειώθηκε και αυτή. Οι λοιμώξεις δέρματος και μαλακών μορίων (Skin and soft tissue infections, SSTIs) επικρατούν συντριπτικά στις σταφυλοκοκοκκικές λοιμώξεις. Ωστόσο, από το 2013 και μετά αναδύθηκε ένας νέος κλώνος MSSA (ST121), που φέρει γονίδια αντοχής στα τοπικά αντιμικροβιακά φουσιδικό οξύ και μουπιροκίνη και παράγει επιδερμολυσίνες. O κλώνος αυτός ευθύνεται για την μεγάλη αύξηση κρουσμάτων μολυσματικού κηρίου. Η αντοχή στα πιο πάνω ευρέως χρησιμοποιούμενα αντιμικροβιακά διευκολύνει την μετάδοση του κλώνου αυτού στην κοινότητα. Επιπλέον, υπάρχει και αύξηση των περιπτώσεων SSSS συνεπεία του κλώνου αυτού. Οι παιδίατροι πρέπει να λάβουν το μήνυμα του περιορισμού της αλόγιστης χρήσης δερματικών αντιμικροβιακών σκευασμάτων στα παιδιά. Ο MRSA και ειδικά ο ST80-IV κλώνος επικράτησε ως αίτιο της CA-SA πνευμονίας στα παιδιά. Η χορηγούμενη αντιμικροβιακή ή/και χειρουργική θεραπεία ήταν αποτελεσματική σε όλες πλην δύο περιπτώσεων, παρόλη τη σχετικά υψηλή MIC στη βανκομυκίνη και το υψηλό ποσοστό αντοχής στην κλινδαμυκίνη.