Προσδιορισμός των οργανοφωσφορικών φυτοφαρμάκων και των μεταβολιτών τους στο αμνιακό υγρό και μελέτη της επίδρασής τους στην εμβρυϊκή ανάπτυξη

Abstract

The aim of this study was to evaluate fetal exposure to organophosphate pesticides by measuring their non-specific dialkyl-phosphate metabolites (DAPs) in amniotic fluid, and to examine the potential association between prenatal exposure and fetal growth. The study was carried out between August 2006 and May 2008. Amniotic fluid samples were collected from 415 women carrying a singleton pregnancy during the second trimester of pregnancy via amniocentesis (for medical indications), to the Fetal-Maternal Unit, Department of Obstetrics and Gynecology, University Hospital of Heraklion, Crete, Greece. The samples were analyzed to the laboratory of Toxicology, Medical School, University of Crete.The determined organophosphate pesticides metabolites were dimethyl phosphate (DMP), dimethyl thiophosphate (DMTP), diethyl phosphate (DEP), diethyl thiophosphate (DETP) and diethyl dithiophosphate (DEDTP). DAPs were extracted by liquid–liquid extraction and measured by gas chromatography– mass spectrometry. Twenty two pregnancies resulted in either fetal demise or termination of pregnancy due to chromosomal abnormalities or major fetal defects. Mean maternal age was 32.7 (SD = 5.7). The mean gestational age at amniocentesis was 18.5 weeks (SD = 2.5). Exposure to organophosphate pesticides expressed as sums of DMPs, DEPs, DAPs in amniotic fluid samples ranged from 0.07 to 222.9 ng/ml, 0.19 to 254.3 ng/ml, and 0.05 to 252.6 ng/ml, respectively. DEP was the metabolite with the higher frequency of detection (90.5%), followed by DETP (74.0%), DMP (60.0%) and DEDTP (39.5%). Almost all amniotic fluid samples (97.8%) provided at least one positive metabolite of pesticides (DMP, DEP, DMTP, DETP, DEDTP), which are common metabolites of about 75% of organophosphate pesticides. DAPs levels did not differ between urban and rural areas (97.8% in urban areas versus 97.9% in rural areas). This makes difficult to pinpoint if the dominant source of exposure is the diet and home pesticide use or agriculture. Maternal age does not affect levels of sumDAPs (p> 0.400). All measured DAPs in the amniotic fluid seem positively associate with each other (p <0.002) and this could potentially be attributed to the simultaneous exposure of the participants to methyl and ethyl organophosphate pesticides. There was no statistically significant difference with neonatal gender and the percentage of the head circumference in the levels of DAPs. Macrosomic neonates had significantly higher sum levels of DMPs (p= 0.043), which exerted a linear positive association with birth-weight centile (b= 4.43, p= 0.016). There is also a seasonal variation in the levels of DAPs which can be explained by the use of specific organophosphate pesticides in certain types of cultivations. The sumDMPs showed elevated levels in autumn of 2006 and 2007 and spring 2008. DMPs derived of O,Odimethyl-substituted organophosphate pesticides such as malathion and dimethoate. The most probable cause of increased dimethyl phosphate metabolite levels in the autumns of 2006 and 2007 is the systematic spraying of olive oil trees for dacus oleae using fenthion and dimethoate during the period between August and September which was approved by the Ministry of Rural Development & Food in Greece. The sumDEPs showed elevated levels in winter 2006–2007 and autumn 2007. DEPs derived from O,O-diethyl-substituted organophosphate pesticides such as chlorpyrifos and diazinon and their elevated levels may be due to the widespread use of diazinon in vineyards and fruit. Conclusively, as DAPs are detectable in amniotic fluid they may be used as a potential biomarker of fetal exposure to organophosphate pesticides. Sum levels of DMPs appear to be associated with birth weight independently of other covariates.

Σκοπός της μελέτης αυτής ήταν να εκτιμήσει την έκθεση του εμβρύου στα οργανοφωσφορικά φυτοφάρμακα, με μέτρηση των μη ειδικών διαλκυλο- φωσφορικών μεταβολιτών τους (dialkyl phosphate metabolites ή DAPs) στο αμνιακό υγρό, και να εξετάσει την πιθανή συσχέτιση ανάμεσα στην προγεννητική έκθεση σε αυτούς τους παράγοντες, την εμβρυϊκή ανάπτυξη και πιθανά προβλήματα υγείας.Η μελέτη διεξήχθη από τον Αύγουστο του 2006 έως το Μάιο του 2008. Συλλέχτηκαν δείγματα αμνιακού υγρού από 415 γυναίκες με μονήρη κύηση στο δεύτερο τρίμηνο της κύησης, κατά τη διάρκεια προγραμματισμένης αμνιοπαρακέντησης (που γινόταν βάσει συγκεκριμένων ιατρικών ενδείξεων), στο τμήμα Εμβρυομητρικής της Μαιευτικής & Γυναικολογικής κλινικής του Πανεπιστημιακού Νοσοκομείου Ηρακλείου. Τα δείγματα αναλύθηκαν στο εργαστήριο Τοξικολογίας, Ιατρικής Σχολής Πανεπιστημίου Κρήτης. Τα DAPs που μετρήθηκαν ήταν τα dimethyl phosphate (DMP), dimethyl thiophosphate (DMTP), diethyl phosphate (DEP), diethyl thiophosphate (DETP) και diethyl dithiophosphate (DEDTP). Οι DAPs εκχυλίστηκαν μετά από υγρή-υγρή επεξεργασία των δειγμάτων (liquid- liquid extraction) και μετρήθηκαν με την αναλυτική τεχνική της αέριας χρωματογραφίας σε συνδυασμό με φασματομετρία μάζας (gas chromatography– mass spectrometry). Είκοσι δύο εγκυμοσύνες είχαν ως αποτέλεσμα είτε απώλεια του εμβρύου είτε τερματισμό της εγκυμοσύνης εξαιτίας χρωμοσωμικών ανωμαλιών ή μεγάλων εμβρυϊκών ελαττωμάτων. Η μέση ηλικία της μητέρας ήταν 32,7 (SD = 5,7). Η μέση ηλικία κύησης κατά την αμνιοπαρακέντηση ήταν 18,5 εβδομάδες (SD = 2,5).Η έκθεση σε οργανοφωσφορικά φυτοφάρμακα, εκφραζόμενη ως άθροισμα DMP, DEP, DAP σε δείγματα αμνιακού υγρού, κυμάνθηκε από 0,07 έως 222,9 ng / ml, 0,19 έως 254,3 ng / ml και 0,05 έως 252,6 ng / ml, αντίστοιχα. Ο DEP ήταν ο μεταβολίτης με την υψηλότερη συχνότητα ανίχνευσης (90,5%), ακολουθούμενη από DETP (74,0%), DMP (60,0%) και DEDTP (39,5%). Σχεδόν όλα τα δείγματα αμνιακού υγρού (97,8%) παρείχαν τουλάχιστον έναν θετικό μεταβολίτη (DMP, DEP, DMTP, DETP, DEDTP), οι οποίοι είναι συνηθισμένοι μεταβολίτες περίπου 75% οργανοφωσφορικών εντομοκτόνων. Δεν παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική διαφορά στα μετρούμενα επίπεδα DAPs μεταξύ αστικών και αγροτικών περιοχών (97,8% στις αστικές περιοχές έναντι 97,9% στις αγροτικές περιοχές). Αυτό καθιστά δύσκολο να εντοπιστεί εάν η κυρίαρχη πηγή έκθεσης είναι η διατροφή και η χρήση φυτοφαρμάκων στο σπίτι ή η γεωργία. Η ηλικία της μητέρας δεν επηρέασε τα επίπεδα των sumDAPs (p> 0.400).Όλα τα μετρηθέντα DAP στο αμνιακό υγρό φαίνεται να συνδέονται θετικά μεταξύ τους (p <0,002) και αυτό θα μπορούσε ενδεχομένως να αποδοθεί στην ταυτόχρονη έκθεση των συμμετεχόντων σε οργανοφωσφορικά φυτοφάρμακα μεθυλίου και αιθυλίου.Δεν υπήρξε στατιστικά σημαντική διαφορά με το φύλο του νεογνού και την εκατοστιαία θέση της περιφέρειας της κεφαλής στα επίπεδα των DAPs. Τα μακροσωμικά νεογνά είχαν σημαντικά περισσότερα συνολικά επίπεδα των DMPs (p= 0.043), παρουσιάζοντας μια γραμμική θετική συσχέτιση με την εκατοστιαία θέση του βάρους γέννησης (b= 4.43, p= 0.016). Υπάρχει επίσης μια εποχική διακύμανση των επιπέδων DAPs που μπορεί να εξηγηθεί από τη χρήση συγκεκριμένων οργανοφωσφορικών φυτοφαρμάκων σε ορισμένους τύπους καλλιεργειών. Τα sumDMPs είχαν αυξημένα επίπεδα το φθινόπωρο του 2006 και του 2007 και την άνοιξη του 2008. Τα DMPs προέρχονται από O,Odimethyl-υποκατεστημένα οργανοφωσφορικά φυτοφάρμακα όπως το malathion και το dimethoate. Η πιο πιθανή αιτία αύξησης των επιπέδων dimethyl phosphate μεταβολίτη το φθινόπωρο του 2006 και του 2007 είναι ο συστηματικός ψεκασμός των ελαιόδεντρων για dacus oleae με τη χρήση fenthion και dimethoate κατά την περίοδο Αυγούστου - Σεπτεμβρίου, που είχε εγκριθεί από το Υπουργείο Αγροτικής Ανάπτυξης και Τροφίμων στην Ελλάδα. Τα sumDEPs παρουσίασαν αυξημένα επίπεδα το χειμώνα 2006-2007 και το φθινόπωρο του 2007. Τα DEP που προέρχονται από O,O-diethyl-υποκατεστημένα οργανοφωσφορικά φυτοφάρμακα όπως το chlorpyrifos και το diazinon και τα αυξημένα επίπεδα τους μπορεί να οφείλονται στην ευρεία χρήση diazinon σε αμπελώνες και φρούτα .Συμπερασματικά, καθώς τα DAPs είναι ανιχνεύσιμα στο αμνιακό υγρό, μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως πιθανοί βιοδείκτες της παρελθοντικής έκθεσης του εμβρύου στα οργανοφωσφορικά φυτοφάρμακα. Τα συνολικά επίπεδα των DMPs φαίνεται να σχετίζονται με το βάρος γέννησης ανεξάρτητα από άλλες μεταβλητές.