Μοριακή ανάλυση της τρινουκλεοτιδικής (CGG)n επέκτασης στο γονίδιο FMR1 του συνδρόμου του εύθραυστου Χ σε γυναίκες με καθ’έξιν αποβολές

Abstract

Background: Miscarriages are termed recurrent when there are two or more involved. In women with recurrent miscarriages, up to 50% of cases remain unexplained. FMR1 gene is susceptible to mutations in the form of recurrent CGG trinucleotide repeats. Women that carry expanded alleles of the FMR1 gene, are known to have diminished reproductive potential, presented as premature ovarian failure. This situation occurs when there are 55 – 200 CGG repeats, a condition known as Fragile X premutation. FMR1 gene alleles with less than 40 CGG repeats are considered normal, while there is uncertainty regarding the area from 41 – 54 repeats (intermediate zone). We evaluated the presence of CGG trinucleotide repeats of the FMR1 gene, in women with unexplained recurrent miscarriages and the impact it might have on reproduction. Methods: This is a prospective case – control pilot study involving 49 women with unexplained recurrent miscarriages and 49 age matched controls with documented fertility. Case group consisted of women with 2 or more consecutive miscarriages, in which no known factor could be identified. Maximum age of recruitment was 40 years. Blood was obtained and checked for the presence of expanded alleles of the FMR1 gene using PCR with electrophoresis. Women marked as positive were further evaluated using sequencing analysis. The limit was set at more than 40 repeats. Results: The repeat sizes of CGG expansions in the FMR1 genes, differ significantly in the two population groups (Man Whitney test, p = 0.027). Four women were found positive for carrying premutation alleles in the miscarriage group and one in the control group (OR: 4.267, ci .459-39.629). All the positive cases involved intermediate zone carriers.The women in the patient group had in average 2.65 ± 0.75 miscarriages, ranging from two up to five. The percentage of women with two miscarriages was 53.1%, with three miscarriages 34.7%, with four miscarriages 10.2% and with five miscarriages 2.0%. The number of miscarriages each woman had, is not associated with the number of the CGG repeats (Kruskal-Wallis test, p = 0.255). Discussion: It is well known that women with premutations of the FMR1 gene are likely to develop premature ovarian failure. On the contrary women with intermediate length alleles do not seem to carry this risk. FMR1 expanded alleles are meiotic unstable and can be inherited as such, or with increased size in the offspring. Additionally, they are the cause of abnormal methylation in the FMR1 gene. It is possible that these unstable mutations can result in defects that are incompatible with life, and lead to miscarriage. This could be proven by performing DNA analysis in the products of conception, in women with recurrent miscarriages, looking for expanded alleles or an otherwise altered FMR1 gene.Many couples that suffer from unexplained recurrent miscarriages are desperately looking for a cause. Perhaps in some of these cases, the CGG expanded allele of the FMR1 gene is to blame. Since this is a prototype study, more are needed before a definite result is drawn.

Εισαγωγή: Η παρουσία δύο ή περισσοτέρων αποβολών ορίζεται ως καθ’ έξιν αποβολές. Στις γυναίκες που πάσχουν από καθ’ έξιν αποβολές, περίπου στο 50% το αίτιο θα μείνει άγνωστο παρά τον πλήρη κλινικο-εργαστηριακό έλεγχο. Το γονίδιο FMR1 υπόκειται σε μεταλλάξεις με τη μορφή τρινουκλεοτιδικών (CGG)n επαναλήψεων. Οι γυναίκες που φέρουν αλληλόμορφα του FMR1 με αυξημένο αριθμό επαναλήψεων CGG, έχουν επιδείνωση του αναπαραγωγικού δυναμικού τους. Αυτό συμβαίνει όταν οι επαναλήψεις είναι από 55 – 200, μια κατάσταση που ονομάζεται προμετάλλαξη του εύθραυστου Χ, και συνδέεται με πρόωρη ωοθηκική ανεπάρκεια. Αριθμός επαναλήψεων CGG μικρότερος των 40 θεωρείται φυσιολογικός, ενώ επικρατεί αβεβαιότητα για την περιοχή 41 -54 επαναλήψεις (ενδιάμεση ζώνη). Στην παρούσα διατριβή εξετάσθηκε η παρουσία των CGG επαναλήψεων σε γυναίκες με καθ’ έξιν αποβολές αγνώστου αιτιολογίας και η επίδραση που πιθανόν αυτές έχουν στη γονιμότητα. Μέθοδοι: Η παρούσα διατριβή αποτελεί μια προοπτική μελέτη ασθενών μαρτύρων και περιλαμβάνει 49 γυναίκες που πάσχουν από καθ’ έξιν αποβολές αγνώστου αιτιολογίας και 49 γυναίκες με αποδεδειγμένη γονιμότητα, ως ομάδα ελέγχου. Η μέγιστη ηλικία εισαγωγής στη μελέτη ήταν τα 40 έτη. Έγινε λήψη φλεβικού αίματος και εξετάσθηκε η παρουσία αλληλόμορφων του FMR1 με αυξημένο αριθμό επαναλήψεων, με τη χρήση μεθόδων PCR και ηλεκτροφόρησης. Τα περιστατικά που ήταν θετικά, ελέγχθηκαν περαιτέρω με τη μέθοδο της αλληλούχισης. Ως όριο για τα θετικά περιστατικά ορίστηκε η παρουσία περισσότερων από 40 CGG επαναλήψεων. Αποτελέσματα: Ο αριθμός των CGG επαναλήψεων διαφέρει σημαντικά στις δύο πληθυσμιακές ομάδες (Man Whitney test, p = 0.027). Βρέθηκαν τέσσερις γυναίκες θετικές στην ομάδα ασθενών και μια στην ομάδα ελέγχου (OR: 4.267, ci .459-39.629). Όλα τα θετικά περιστατικά ανήκουν στην ενδιάμεση ζώνη.Οι γυναίκες στην ομάδα ασθενών είχε κατά μέσο όρο 2.65 ± 0.75 αποβολές, με διακύμανση από δύο μέχρι πέντε. Το ποσοστό των γυναικών με δύο αποβολές ήταν 53,1%, με τρεις 34,7%, με τέσσερις 10,2% και με πέντε αποβολές 2,0%. Ο αριθμός των αποβολών δε σχετίζεται με τον αριθμό των CGG επαναλήψεων (Kruskal-Wallis test, p = 0.255). Συζήτηση: Είναι γνωστό ότι οι γυναίκες που φέρουν προμετάλλαξη του FMR1 γονιδίου, έχουν κίνδυνο να εμφανίσουν πρόωρη ωοθηκική ανεπάρκεια. Αντιθέτως οι γυναίκες στην ενδιάμεση ζώνη CGG επαναλήψεων, δε φέρουν αυτόν τον κίνδυνο. Τα αλληλόμορφα του FMR1 με αυξημένο αριθμό επαναλήψεων, μπορούν να κληρονομηθούν στους απογόνους αυτούσια, ή με αύξηση του αριθμού των επαναλήψεων. Επιπρόσθετα, το FMR1 γονίδιο να υποστεί μεθυλίωση. Είναι πιθανό αυτές οι ασταθείς μεταλλάξεις να οδηγούν σε βλάβες που είναι ασύμβατες με τη ζωή και να προκαλούν τελικά αποβολή στο κύημα. Αυτή η θεωρία θα μπορούσε να υποστηριχθεί περαιτέρω με ανάλυση στο DNA των προϊόντων αποβολής, αναζητώντας είτε αλληλόμορφα γονίδια με αυξημένο αριθμό επαναλήψεων CGG, είτε με άλλο τρόπο επηρεασμένο γονίδιο FMR1 (π.χ. μεθυλίωση). Πολλά ζευγάρια που πάσχουν από καθ’ έξιν αποβολές, ψάχνουν εναγωνίως για αίτια και θεραπεία. Πιθανώς, για κάποιες από αυτές τις περιπτώσεις, να ευθύνεται η παρουσία αλληλόμορφων του FMR1 με αυξημένο αριθμό επαναλήψεων. Η παρούσα διατριβή δύναται να αποτελέσει μια πιλοτική μελέτη – οδηγό, για επόμενες εργασίες, που τελικά θα επιβεβαιώσουν ή θα απορρίψουν τον παραπάνω συσχετισμό