Μοριακή και βιοχημική ανάλυση των βακτηριακών παρβουλινών και κυκλοφιλινών

Abstract

The peptidyl prolyl cis/trans isomerases (PPIases, EC 5.2.1.8) are enzymes that accelerate the slowcis/trans isomerization of peptidyl-prolyl bonds in different folding states of a target protein, while, theycan also act on polypeptides, as folding helper enzymes. Prolyl isomerases are ubiquitous proteins, whichare found in all organisms and all cellular compartments. At least three different families, cyclophilins,FK506-binding proteins (FKBPs) and parvulins constitute the enzyme class of PPIases. Additionally to theproven isomerase function of the majority of PPIase family members, they also demonstrate chaperoneactivity which allows them to prevent both newly synthesized polypeptide chains and assembled subunitsfrom aggregating into nonfunctional structures, inducing conformational changes in mature target proteins,altering their structure and intermolecular interactions, thus affecting their activity. PPIases have beenfound to take part in a great number of physiological processes such as heat shock response, transcriptionand translation, signal transduction, tumor metastasis, pathogen virulence, cell cycle control and others.Bacterial PPIases although appear to be non essential for growth under laboratory conditions they havesignificant roles in survival in inviromental and pathogenic niches.The main objective of the present study was to explore the biochemical and molecular function of theEscherichia coli parvulins and cyclophilins. Our goal was initially addressed through the analysis of thefully sequenced genome of E. coli, which revealed the existence of three and two members of the parvulinsand cyclophilins, respectively. The physiological role of parvulins and cyclophilins of E. coli was exploitedby examining the growth of strains ΔppiC, ΔsurA, ΔppiD, ΔppiB and ΔppiA, lacking each PPIase gene,under various conditions. Characterization of parvulins and cyclophilins mutants revealed that the absencesome of these proteins resulted in pleiotropic phenotypes, including increased swarming and swimmingmotility in addition to enhanced biofilm formation.We asked whether the prolyl isomerase activity of these enzymes is involved in the observedphenotypes. To this end, cyclophilin and parvulin proteins with PPIase active site mutations, (PpiBF99A,PpiBR43A, PpiAF128A, PpiCC41A) were constructed by site-directed mutagenesis and tested whether theresulting mutants complement the respective ΔppiB, ΔppiA and ΔppiC strains under swimming, swarmingand biofilm conditions. Complementation with cyclophilins and parvulins genes and also with therespective PPIase-deficient genes, restored the motility and sessility phenotypes, suggesting that PPIaseactivity seems to be unnecessary in these motile behaviors. The exception is PpiBR43A, where failed torescue the biofilm phenotype, suggesting the involvement of PPIase activity in this behavior.Furthermore, since PPIases constitute three convergently evolved gene families, we attempted to clarifythe functional redundancy of the cyclophilins and parvulins with the other members of the three PPIases families. Multi-copy suppressor screens demonstrated that the expression of the majority of PPIaseencoding genes restored swarming and swimming motility and biofilm formation of E. coli cyclophilinsand parvulins mutant strains.Moreover, the motility and sessility phenotype of PpiB mutant strain was restored by over-expressingseveral putative prey proteins which upon deletion are often characterized by analogous phenotypes. Wewere able to verify several interactions through various in vivo and in vitro interaction screens. Many of theinteractions engage the PPIase active site, since in the presence of these putative prey proteins the in vitrocatalytic activity of the enzyme was diminished. Ιn the case of DnaK, AccC and Pta we also revealed adirect role of PpiB in the functional control of these proteins since it increased the measured enzymeactivity of each protein and further interfered with DnaK localization and the correct folding of AccC. Cells overexpressing ppiB and ppiC genes exhibited an elongated cell phenotype who failed to dividenormally, unlikely to cells overexpressing the respective PPIase-deficient genes, indicating that PPIaseactivity of these proteins is affecting cell length. Additional, PpiB and PpiC are functionally associatedwith cell division of E. coli, since the two proteins interact with FtsZ and ZipA, two cell division proteinsrequired for the formation of the Ζ ring. Furthermore, PpiB decreases the GTPase activity of FtsZ andwhen overexpressed shows an inhibitory effect on ITS proper localization at future division sites. Takentogether, these results indicate that PpiB and PpiC are able to modulate bacterial cell division via itsfunctional association with proteins directly related to the process.

Οι πεπτιδύλ-προλύλ cis/trans ισομεράσες (PPIάσες, EC: 5.2.1.8) αποτελούν μια υπεροικογένεια ενζύμων που καταλύουν την αργή διαδικασία της cis/trans ισομερίωσης των πεπτιδικών δεσμών που προηγούνται της προλίνης, σε διαφορετικά στάδια αναδίπλωσης των πρωτεϊνών στόχων, ως ένζυμα πουβοηθούν την αναδίπλωση. Οι πεπτιδύλ-προλύλ cis/trans ισομεράσες, είναι ένζυμα που απαντώνται σε όλους τους οργανισμούς και σε όλα τα κυτταρικά διαμερίσματα. Τα μέλη της υπεροικογένειας τωνPPIασών διακρίνονται στις εξής οικογένειες: τις κυκλοφιλίνες (Cyclophilins), τις πρωτεΐνες που δεσμεύουν το FK506 (FKBPs) και τις παρβουλίνες (Parvulins). Οι τρεις οικογένειες PPIασών έχουν διακριτά υποστρώματα ενώ έχουν αποδειχθεί ευαίσθητες σε διαφορετικούς τύπους αναστολέων. Η πλειονότητα τωνPPIασών, εκτός από την ενεργότητα PPIάσης, εμφανίζουν και ενεργότητα τσαπερόνης μέσω της οποίας επιτελείται η αναδίπλωση πρωτεϊνών και παρεμποδίζεται η δημιουργία πρωτεϊνικών συσσωματωμάτων.Επίσης, οι PPIάσες έχει βρεθεί ότι εμπλέκονται σε ένα μεγάλο αριθμό φυσιολογικών διεργασιών όπως είναι η απόκριση θερμικού στρες, η μεταγραφή και η μετάφραση, η μεταγωγή σήματος, η μετάσταση όγκου, η μολυσματικότητα παθογόνων, ο έλεγχος του κυτταρικού κύκλου και άλλα. Οι βακτηριακές PPIάσες ενώ δε φαίνεται να είναι απαραίτητες για την ανάπτυξη υπό εργαστηριακές συνθήκες, έχουν σημαντικούς ρόλους στην επιβίωση σε ιδιαίτερες περιβαλλοντικές συνθήκες.Σκοπός της παρούσας μελέτης είναι ο βιοχημικός και μοριακός χαρακτηρισμός των μελών, δύο οικογενειών των PPIασών, των κυκλοφιλινών και των παρβουλινών, του μικροοργανισμού Escherichiacoli. Αρχικά, πραγματοποιήθηκε η ανάλυση του πλήρως αλληλουχημένου γονιδιώματος του βακτηρίου μέσω της οποίας εντοπίστηκαν τρία και δύο γονίδια αντίστοιχα, που κωδικοποιούν για πρωτεΐνες που ανήκουν στις παρβουλίνες και στις κυκλοφιλίνες. Ο φυσιολογικός ρόλος των παρβουλινών και των κυκλοφιλινών μελετήθηκε μέσω της ανάπτυξης, σε διαφορετικές συνθήκες, των E. coli στελεχών ΔppiC,ΔsurA, ΔppiD, ΔppiB και ΔppiA στα οποία έχει απαλοιφθεί το συγκεκριμένο γονίδιο. Η απουσία κάποιων παρβουλινών και κυκλοφιλινών είχε ως αποτέλεσμα πλειοτροπικούς φαινοτύπους, οι οποίοι περιλαμβάνουν αυξημένη ικανότητα κολυμβητικής και επιφανειακής ομαδικής κίνησης, καθώς καιαυξημένη ικανότητα σχηματισμού βιοϋμενίου, συγκριτικά με το στέλεχος αγρίου τύπου.Εξετάστηκε εάν η ενεργότητα PPIάσης αυτών των ενζύμων εμπλέκεται στους παρατηρούμενους φαινότυπους. Για αυτό το σκοπό, δημιουργήθηκαν στελέχη τα οποία φέρουν κατευθυνόμενες σημειακές μεταλλάξεις αμινοξέων που μετέχουν στον ενεργό κέντρο PPIάσης κάθε πρωτεΐνης (PpiBF99A, PpiBR43A,PpiAF128A, PpiCC41A) και ελέγχθηκε εάν αυτά τα στελέχη συμπληρώνουν τα αντίστοιχα μεταλλαγμένα στελέχη στην ομαδική και κολυμβητική κίνηση και στο σχηματισμό βιοϋμενίου. Η έκφραση των γονιδίων αγρίου τύπου αλλά και των μεταλλαγμένων γονιδίων των κυκλοφιλινών και των παρβουλινών στα αντίστοιχα μεταλλαγμένα στελέχη επανέφερε σε όλες τις περιπτώσεις τους φαινοτύπους του στελέχους αγρίου τύπου. Εξαίρεση αποτέλεσε το μεταλλαγμένο γονίδιο της κυκλοφιλίνης PpiBR43A, όπου δεν επανέφερε το φαινότυπο του σχηματισμού βιοϋμενίου, υποδηλώνοντας τη αναγκαιότητα της δραστικότητας ΡΡΙάσης της κυκλοφιλίνης σε αυτή τη συμπεριφορά.Ο φαινότυπος των μεταλλαγμένων στελεχών ΔppiC, ΔsurA, ΔppiD, ΔppiB και ΔppiA επανήλθε στα επίπεδα αγρίου τύπου μέσω υπερέκφρασης της πλειοψηφίας των γονιδίων που κωδικοποιούν για τις PPIάσες του E. coli, υποδηλώνοντας ότι είναι δυνατή μια λειτουργική υποκατάσταση ανάμεσα στα μέλητης υπεροικογένειας των PPIασών.Η αυξημένη ικανότητα ομαδικής, κολυμβητικής κίνησης και σχηματισμού βιοϋμενίου του στελέχους ΔppiB επανήλθε σε φυσιολογικά επίπεδα έπειτα από την υπερέκφραση πρωτεϊνών που αποτελούν πιθανούς στόχους της PpiB, των οποίων τα μεταλλαγμένα στελέχη σε αρκετές περιπτώσεις παρουσίασα νανάλογους φαινότυπους με το στέλεχος ΔppiB. Επιβεβαιώθηκαν αρκετές αλληλεπιδράσεις των πιθανών πρωτεϊνών στόχων με την PpiB χρησιμοποιώντας διάφορες in vivo και in vitro μεθόδους αλληλεπίδρασης πρωτεϊνών. Πολλές από αυτές τις αλληλεπιδράσεις εμπλέκουν το ενεργό κέντρο PPIάσης της, αφού με την παρουσία των πιθανών αυτών στόχων παρατηρήθηκε μείωση της in vitro ενεργότητας PPIάσης της κυκλοφιλίνης. Στην περίπτωση, των DnaK, AccC και PtA βρέθηκε ότι η κυκλοφιλίνη διαδραματίζει έναν ρόλο στον άμεσο λειτουργικό έλεγχο αυτών των πρωτεϊνών, αφού η παρουσία της αυξάνει την μετρούμενη ενζυμική ενεργότητα της καθεμίας πρωτεΐνης. Επίσης, η PpiB εμπλέκεται στον υποκυτταρικό εντοπισμό της DnaK ενώ φαίνεται ότι είναι υπεύθυνη για την ορθή αναδίπλωση της AccC.Εξετάζοντας την κυτταρική μορφολογία των στελεχών που υπερεκφράζουν την κυκλοφιλίνη PpiB και την παρβουλίνη PpiC παρατηρήθηκε μια σημαντική κυτταρική επιμήκυνση, γεγονός που υποδηλώνει την εμπλοκή των παραπάνω ενζυμών στην κυτταρική διαίρεση. Αντίθετα, τα στελέχη τα οποία υπερεκφράζουντα μεταλλαγμένα στο ενεργό κέντρο γονίδια, ppiBF99A, ppiBR43A και ppiCC41A, παρουσιάζουν κυτταρική μορφολογία όμοια με αυτή του αγρίου τύπου, γεγονός που υποδηλώνει ότι η ενεργότητα PPIάσης των δυο πρωτεϊνών είναι αναγκαία. Επιπλέον, οι δύο πρωτεΐνες αλληλεπιδρούν με τις FtsZ και ZipA πρωτεΐνες της κυτταρικής διαίρεσης. Η παρουσία της PpiB μειώνει τη ενεργότητα GTPάσης της FtsZ και έχει αρνητική επίδραση στη σωστή τοποθέτησή της στις μελλοντικές θέσεις διαίρεσης. Τα παραπάνω αποτελέσματα υποδηλώνουν τη συμμετοχή των PpiB και PpiC στην κυτταρική διαίρεση μέσω της λειτουργικής τους συσχέτισης με πρωτεΐνες άμεσα εμπλεκόμενες σε αυτήν τη διαδικασία.