Διερεύνηση των αλληλεπιδράσεων μεταξύ ριζοβακτηρίων που προωθούν τη φυτική ανάπτυξη (PGPR) και γεωργικών φαρμάκων

Abstract

The aim of the present thesis was to investigate the influence of specific plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR) belonging to the genus Bacillus (B. amyloliquefaciens IN937a, B. pumilus SE34, B. subtilis FZB24, B. subtilis GB03) on the degradation of pesticides and to study the possible effects of pesticides on bacterial populations. Five pesticides among different chemical groups were evaluated including acibenzolar-S-methyl (SAR activator), metribuzin and napropamide (herbicides), propamocarb hydrochloride (fungicide) and thiamethoxam (insecticide). The experiments were performed under controlled conditions in liquid cultures and field soils at two application levels. For the determination of pesticide residues a new extraction method was developed and instrumental analysis was carried out by liquid chromatography coupled with triple quadrupole mass spectrometry (LC-MS/MS) and a liquid chromatographic system coupled with a diode array detector (HPLC-DAD). The bacterial populations (CFU) were determined using serial dilutions technique and plating. The results revealed that the introduction of PGPR inocula in sterile conditions (liquid cultures and sterilized soil) significantly enhanced the degradation of certain pesticides. Acibenzolar-S-methyl added in liquid cultures of rhizobacteria was degraded between 58 to 100% in 24 hours and the strain B. pumilus SE34 showed the highest degradation rate. For the remaining pesticides, the inoculation with the PGPR strains degraded metribuzin, napropamide, propamocarb hydrochloride and thiamethoxam by 8-18%, 9-11%, 15-36% and 11-22%, respectively, within 72-h incubation. In sterile soil, acibenzolar-S-methyl exhibited similar behavior with rapid degradation and DT50 values <16.4 days in the PGPR treatments compared with > 34.2 days determined in the control. The degradation of propamocarb hydrochloride and thiamethoxam was increased in soil samples incorporated with B. amyloliquefaciens IN937a and B. pumilus SE34 strains in comparison to samples with no bacterial treatment. However, the inoculation of PGPR strains in natural field soil did not affect the degradation rate of the pesticides studied. Bacterial growth in the presence of pesticides in both pesticide fortification levels were satisfactory and in some cases there was even a stimulatory effect of pesticides on the growth of bacteria, increasing the populations of bacterial cells. The further investigation was focused on the behavior and fate of acibenzolar-S-methyl in the rhizosphere of tomato plants, grown under greenhouse conditions and after root application of the PGPR strains, as well its ability of uptake and systemic translocation of residues in aboveground tomato plants was also investigated. In addition, the colonization of strain B. subtilis GB03 at the tomato plant root system and rhizosphere soil was studied and the effect of acibenzolar-S-methyl on strain populations was also evaluated. The results showed that the addition of PGPR inocula did not affect the degradation rate of acibenzolar-S-methyl in rhizosphere soil and the formation of the main metabolite CGA 210007 was rapid. It was found that in plants treated with the strains B. subtilis GB03 and B. pumilus SE34 the uptake and systemic translocation of acibenzolar-S-methyl and CGA 210007 in the aerial parts of the tomato plants was significantly higher compared to the control. In order to study the colonization ability of the strain B. subtilis GB03 in tomato plant rhizosphere, transformation with a plasmid vector (pAD43-25) introducing genetic material translated into a green fluorescent protein (GFP) was also performed. The colonization was higher in the root system compared to the rhizosphere soil, while there was a negative effect of acibenzolar-S-methyl in the development of this strain in the rhizosphere soil.

Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής αποτέλεσε η διερεύνηση της επίδρασης συγκεκριμένων ριζοβακτηρίων που προάγουν τη φυτική ανάπτυξη (Plant Growth-Promoting Rhizobacteria, PGPR) του γένους Bacillus (B. amyloliquefaciens IN937a, B. pumilus SE34, B. subtilis FZB24, B. subtilis GB03) στην αποδόμηση γεωργικών φαρμάκων και η μελέτη των πιθανών επιδράσεων των γεωργικών φαρμάκων στους βακτηριακούς πληθυσμούς. Μελετήθηκαν πέντε γεωργικά φάρμακα διαφορετικών χημικών ομάδων, συμπεριλαμβανομένων των acibenzolar-S-methyl (ενεργοποιητής SAR), metribuzin και napropamide (ζιζανιοκτόνα), propamocarb hydrochloride (μυκητοκτόνο) και thiamethoxam (εντομοκτόνο). Τα πειράματα πραγματοποιήθηκαν σε ελεγχόμενες συνθήκες σε θρεπτικά υποστρώματα και εδάφη αγρού σε δύο επίπεδα συγκέντρωσης. Για τον προσδιορισμό των υπολειμμάτων των παραπάνω ουσιών αναπτύχθηκε νέα μέθοδος εκχύλισης και η χρωματογραφική ανάλυση πραγματοποιήθηκε σε σύστημα υγρής χρωματογραφίας συνδεδεμένο με ανιχνευτή φασματομετρίας μάζας τριπλού τετραπόλου (LC-MS/MS) και σε σύστημα υγρής χρωματογραφίας με ανιχνευτή με διάταξη φωτοδιόδων (HPLC-DAD). Οι βακτηριακοί πληθυσμοί (CFU) προσδιορίστηκαν με τη μέθοδο των διαδοχικών αραιώσεων και της επιφανειακής επίστρωσης. Από τα αποτελέσματα προκύπτει ότι η εισαγωγή εμβολίων PGPR σε αποστειρωμένες συνθήκες (υγρές καλλιέργειες και αποστειρωμένο έδαφος) αύξησε σημαντικά την αποδόμηση ορισμένων γεωργικών φαρμάκων. Το acibenzolar-S-methyl σε υγρές καλλιέργειες των ριζοβακτηρίων αποδομήθηκε σε 24 ώρες κατά 58 έως 100% και το στέλεχος B. pumilus SE34 παρουσίασε τη μεγαλύτερη ταχύτητα αποδόμησης. Στα υπόλοιπα γεωργικά φάρμακα, ο εμβολιασμός των υποστρωμάτων με τα στελέχη PGPR προκάλεσε αποδόμηση των metribuzin, napropamide, propamocarb hydrochloride και thiamethoxam που κυμάνθηκε στις διάφορες επεμβάσεις μεταξύ 8-18%, 9-11%, 15-36% και 11-22%, αντίστοιχα, με την ολοκλήρωση του χρόνου επώασης. Σε αποστειρωμένο έδαφος, το acibenzolar-S-methyl εμφάνισε παρόμοια συμπεριφορά με ταχεία αποδόμηση και τιμές DT50 <16.4 ημέρες στις επεμβάσεις με τα PGPR σε σύγκριση με τιμές DT50>34.2 ημέρες που προσδιορίστηκαν στους μάρτυρες. Ο ρυθμός αποδόμησης των propamocarb hydrochloride και thiamethoxam αυξήθηκε σε εδαφικά δείγματα που ενσωματώθηκαν τα στελέχη B. amyloliquefaciens IN937a και B. pumilus SE34, σε σχέση με δείγματα που δεν δέχτηκαν βακτηριακή μεταχείριση. Ωστόσο, ο εμβολιασμός των βακτηρίων PGPR σε φυσικό έδαφος αγρού δεν επηρέασε το ρυθμό αποδόμησης των γεωργικών φαρμάκων που μελετήθηκαν. Η βακτηριακή ανάπτυξη παρουσία των γεωργικών φαρμάκων και στα δύο επίπεδα επιφόρτισης ήταν ικανοποιητική και μάλιστα σε ορισμένες περιπτώσεις παρατηρήθηκε ακόμη και διεγερτική δράση των ουσιών στην ανάπτυξη των βακτηρίων, αυξάνοντας τους πληθυσμούς των βακτηριακών κυττάρων. Η περαιτέρω έρευνα επικεντρώθηκε στη συμπεριφορά και τύχη του acibenzolar-S-methyl στη ριζόσφαιρα φυτών τομάτας, που αναπτύχθηκαν σε θερμοκηπιακές συνθήκες και μετά από ριζοεμβολιασμό με τα PGPR, καθώς και στην ικανότητα πρόσληψης και διασυστηματικής μετακίνησης των υπολειμμάτων στο υπέργειο μέρος των φυτών. Επιπλέον, μελετήθηκε η ικανότητα αποικισμού του στελέχους B. subtilis GB03 στη ρίζα των φυτών τομάτας και στο έδαφος της ριζόσφαιρας και παράλληλα αξιολογήθηκε και η πιθανή επίδραση του acibenzolar-S-methyl στους πληθυσμούς του στελέχους. Η προσθήκη των PGPR δεν επηρέασε το ρυθμό αποδόμησης του acibenzolar-S-methyl στο έδαφος και ο σχηματισμός του κύριου μεταβολίτη του CGA 210007 ήταν γρήγορος. Διαπιστώθηκε ότι σε φυτά που έγινε μεταχείριση με τα στελέχη B. subtilis GB03 και B. pumilus SE34 η πρόσληψη και διασυστηματική μετακίνηση των acibenzolar-S-methyl και CGA 210007 στο υπέργειο μέρος των φυτών τομάτας ήταν σημαντικά υψηλότερη ως προς το μάρτυρα Για τη μελέτη της ικανότητας αποικισμού του στελέχους B. subtilis GB03 στη ριζόσφαιρα φυτών τομάτας, δοκιμάστηκε ο μετασχηματισμός του με πλασμιδιακό φορέα (pAD43-25) εισάγοντας γενετικό υλικό που κωδικοποιεί πράσινη φθορίζουσα πρωτεΐνη (GFP). Ο βαθμός αποικισμού του στελέχους ήταν μεγαλύτερος στο ριζικό σύστημα των φυτών σε σύγκριση με το έδαφος της ριζόσφαιρας, ενώ παρατηρήθηκε αρνητική επίδραση του acibenzolar-S-methyl στην ανάπτυξη του στελέχους στο έδαφος της ριζόσφαιρας.