Μελέτη του σηματοδοτικού μονοπατιού BAFF/APRIL στην οξεία λεμφοβλαστική λευχαιμία

Abstract

BAFF and APRIL are master regulators of survival, maturation and homeostasis of normal developing B-cells, by interacting with three cognate receptors, BAFFR, TACI and BCMA. Despite the lack of a functional role of BAFF/APRIL system during normal early B-cell development, previous studies indicated a possible contribution of these molecules in the pathogenesis of B-lineage acute lymphoblastic leukemia (B-ALL), a heterogeneous disease arising from the malignant transformation of progenitor B-cells. Herein, we evaluated the expression of this system in B-ALL and its involvement in spontaneous and drug-induced apoptosis of B-lymphoblasts, taking into consideration the distinct disease subtypes. The mRNA expression of BAFF, APRIL and their receptors was evaluated by RT-PCR in 70 patients with ALL (children and adults), while receptors’ protein expression was measured by flow cytometry. According to our results, we performed ChIP experiments in the E2A-PBX1+ pre-B-ALL cell line 697 and we investigated binding of the E2A-PBX1 chimeric transcription factor in possible regulatory regions of BAFFR gene. The functionality of BAFFR was assessed by treating B-lymphoblasts with exogenous BAFF and checking the NF-κΒ2 activation by Western blot. We also evaluated the contribution of BAFF/BAFFR crosstalk in spontaneous and drug-induced apoptosis in B-lymphoblasts. Last but not least, we checked the activation of signaling pathways (NF-κΒ2, PI3K & NF-κΒ1) in BAFF/dexamethasone treated cells. We found that BAFFR is the most predominant aberrantly expressed receptor in B-ALL at mRNA and protein level and its expression, along with those of BCMA and APRIL, was correlated with the maturation stage of B-lymphoblasts. Moreover, the binding of the E2A-PBX1 chimeric protein to BAFFR promoter, suggests a potential mechanism explaining the increased BAFFR expression observed in a proportion of pre-B-ALL patients carrying the E2A-PBX1 translocation. Despite its aberrant expression in B-ALL, binding of BAFF to BAFFR activates the NF-κΒ2, the major signaling pathway downstream of BAFF/BAFFR crosstalk, indicating that the receptor is functional, while it induces BAFFR processing by cell membrane, regulating its levels. However, we found that BAFF-treatment increased the spontaneous cell death of BAFFR+ B-lymphoblasts in patients with BCR-ABL+ pre-B-ALL. This finding was strengthened by the fact that BAFF enhanced the glucocorticoid-induced apoptosis in 697 cells, without changing the dynamics of these cells in activating NF-κΒ2 and in BAFFR processing. These data suggest a disease-subtype specific role of BAFF/APRIL system in B-ALL pathogenesis.

Οι κυτταροκίνες BAFF και APRIL συμβάλλουν στην επιβίωση, ωρίμανση, ομοιόσταση και διαφοροποίηση των φυσιολογικών Β-κυττάρων, μέσω της αλληλεπίδρασής τους με τρεις υποδοχείς, τους BAFFR, TACI και BCMA. Παρά την απουσία ενός λειτουργικού ρόλου του BAFF/APRIL συστήματος κατά τα πρώιμα στάδια ανάπτυξης των προγονικών Β-κυττάρων στο μυελό των οστών, προηγούμενες μελέτες έδειξαν μία πιθανή συμμετοχή αυτών των μορίων στην παθογένεση της Β-οξείας λεμφοβλαστικής λευχαιμίας (Β-ΟΛΛ). Η τελευταία συνιστά μια ετερογενή νοσολογική οντότητα, που προκύπτει από την κακοήθη εξαλλαγή των προγονικών Β-κυττάρων. Στην παρούσα μελέτη, αξιολογήσαμε την έκφραση των μορίων του BAFF/APRIL συστήματος στη Β-ΟΛΛ και τη συμμετοχή τους στην αυθόρμητη και στην επαγόμενη από φάρμακα απόπτωση των Β-λεμφοβλαστών, λαμβάνοντας υπόψη τους διακριτούς υποτύπους της νόσου. Η mRNA έκφραση των μορίων του συστήματος αυτού μελετήθηκε σε 70 ασθενείς με ΟΛΛ (παιδιά κι ενήλικες) με RT-PCR, ενώ η πρωτεϊνική έκφραση των υποδοχέων μελετήθηκε σε 12 από αυτούς με κυτταρομετρία ροής. Στη βάση των αποτελεσμάτων μας, πραγματοποιήσαμε πειράματα ανοσοκατακρήμνισης χρωματίνης στην E2A-PBX1+ κυτταρική σειρά προ-Β-ΟΛΛ, 697, και διερευνήσαμε με qPCR την πρόσδεση του E2A-PBX1 χιμαιρικού μεταγραφικού παράγοντα σε περιοχές με πιθανή ρυθμιστική δράση στο BAFFR γονίδιο. Η λειτουργικότητα του BAFFR διερευνήθηκε έπειτα από καλλιέργεια Β-λεμφοβλαστών με BAFF κι έλεγχο της ενεργοποίησης του NF-κΒ2 με Western blot, ενώ αξιολογήθηκαν τα πρωτεϊνικά επιπέδα του υποδοχέα για τις ίδιες συνθήκες. Η συμβολή της αλληλεπίδρασης BAFF/BAFFR στην αυθόρμητη και στην επαγόμενη από φάρμακα (αρασυτίνη, γλυκοκορτικοειδή) απόπτωση των Β-λεμφοβλαστών μελετήθηκε με κυτταρομετρία ροής. Τέλος, διερευνήθηκε η επίδραση της συγκαλλιέργειας BAFF/δεξαμεθαζόνης στα επίπεδα του BAFFR, και στην ενεργοποίηση σηματοδοτικών μονοπατιών (NF-κΒ2, PI3K & NF-κΒ1). Διαπιστώσαμε ότι ο BAFFR ήταν ο κύριος υποδοχέας του συστήματος που εκφράζεται απρόσφορα σε μεταγραφικό και πρωτεϊνικό επίπεδο στη Β-ΟΛΛ, και η έκφρασή του αυτή, καθώς επίσης και των BCMA & APRIL συνδεόταν με το στάδιο ωρίμανσης των κυττάρων. Επιπλέον, η πρόσδεση του χιμαιρικού μεταγραφικού παράγοντα E2A-PBX1 στον υποκινητή του BAFFR γονιδίου προτείνει ένα πιθανό μηχανισμό που θα μπορούσε να αιτιολογεί την αυξημένη έκφραση του BAFFR σε ένα ποσοστό ασθενών με την E2A-PBX1 μετατόπιση. Παρά την απρόσφορη έκφρασή του στη Β-ΟΛΛ, η δέσμευση του BAFF στον BAFFR ενεργοποιεί την κύρια σηματοδοτική οδό, του NF-κΒ2, υποδεικνύοντας ότι ο υποδοχέας είναι λειτουργικός, ενώ οδηγεί και σε αποικοδόμηση από την κυτταρική μεβράνη του BAFFR, ρυθμίζοντας έτσι τα πρωτεϊνικά του επίπεδα. Παρόλα αυτά, διαπιστώσαμε ότι η επώαση με BAFF ενίσχυσε τον αυθόρμητο κυτταρικό θάνατο των BAFFR+ Β-λεμφοβλαστών ασθενών με BCR-ABL+ προ-Β-ΟΛΛ. Το εύρημα αυτό ισχυροποιήθηκε από το γεγονός ότι ο BAFF ενέτεινε την επαγόμενη από γλυκοκορτικοειδή απόπτωση της 697 σειράς, χωρίς να επηρεάζει τη δυναμική των κυττάρων να ενεργοποιούν τον NF-κΒ2 και να αποικοδομούν τον BAFFR. Τα δεδομένα αυτά προτείνουν ένα ρόλο του BAFF-APRIL συστήματος στη Β-ΟΛΛ, ειδικό για τον υπότυπο της νόσου.