Αλληλεπίδραση μεταβιβαστών φλεγμονής και κυτταρικών πληθυσμών του αναπνευστικού επιθηλίου στην παθογένεια της ιδιοπαθούς πνευμονικής ίνωσης

Abstract

Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) is a progressive fibrotic lung disease of unknown cause that leads to respiratory failure and death within 3-5 years of diagnosis. The exact triggers, which initiate the fibrotic process, remain unknown. IPF is characterized by myofibroblast recruitment and activation/excessive collagen secretion. Accumulated myofibroblasts, stimulated locally, express enhanced fibrotic activity. Tumor necrosis factor- Like cytokine 1 A (TL1A), a member of the TNF-α superfamily, is a novel fibrogenic factor, which plays a major role in inflammatory bowel disease pathogenesis. Its role in IPF has never been investigated. Our aim was to explore: 1) The possible role of pro-fibrotic responses of human Subepithelial Lung Myofibroblasts (SELM) in the development of fibrosis in IPF patients and controls, and 2) The role of TL1A in the pathogenesis of IPF. SELM were isolated from surgical specimens of healthy lung tissue and cultured, stimulated or unstimulated, with pro-inflammatory cytokines (rhTNF-α, rhIL-1α and rhIFN-g) added alone or in combination and with bronchoalveolar lavage fluid (BALF) from patients with IPF or idiopathic non- specific interstitial pneumonia (iNSIP) and controls (non-ILD). Fibrotic activity of HLM was assessed through collagen production in culture supernatants and the wound healing method. In addition, total RNA was extracted from Subepithelial Lung Myofibroblasts (SELM), mRNA was processed for tissue factor (TF) and TL1A protein with RT-PCR. TL1A levels were accessed by immunochemistry. Data were presented as the mean ± standard deviation of the mean (SD) of at least 3 independent experiments. Comparative statistical evaluation between groups was performed by ANOVA Bonferroni t post-hoc analysis and Student's t-test were used for statistical comparison between individual variables, as appropriate. Statistical significance was established at a level of p < 0.05.In the present study, we found that SELM stimulation with IPF-BALF (n=3) or with the combination of cytokines (IL-1α+TNF-α+IFN-γ) produced a statistically significant increase of collagen levels (IPF1: 183.99 μg/ml±14.03, p<0.01, IPF2: 118.50 μg/ml±5.04, p<0.05, IPF3: 126.23 μg/ml±2.7, p<0.05 and 3C: 184.72 μg/ml±29.72, p<0.05 compared to unstimulated: 63 μg/ml±1.2). In addition, stimulation of SELM with BALF-IPF or with pro- inflammatory cytokines (IL-1α, TNF-α) demonstrated a significant increase in the transcription activity of TF (IPF: 3.56-fold±0.14, IL-1α: 2.5-fold±0.08, TNF-α: 2.3-fold±0.007, 2C: 2.7-fold±0.17, p<0.05 compared to unstimulated: 1.1-fold±0.3) and TL1A (IPF: 6.5-fold±0.8, IL-1α: 156-fold±14.94, TNF-α: 240- fold±7.8, 2C: 116-fold±3.6, p<0.01 compared to unstimulated: 1.3-fold±0.6). TL1A levels were confirmed by immunofluorescence. This is the first time TL1A has been measured in lung SELM. Finally, stimulation of SELM with pro-inflammatory cytokines didn’t induce any significant increase in migratory activity in contrast to stimulation with BALF (IPF2: 43.69%±2.16, p<0.01, IPF3: 36.49%±2.37, p<0.05).In conclusion, the BALF from patients with IPF induces the fibrotic activity of a pro-fibrotic activity in human lung myofibroblasts of the patients with IPF, in the same manner the fibrotic mediators that are related to pulmonary fibrosis, suggesting a crucial role for the subepithelial myofibroblasts in IPF. TL1A cytokine is a major pro-inflammatory cytokine that is abundantly expressed in fibrotic lesions and induces a pro-fibrotic activity in human lung myofibroblasts of the patients with IPF. Similar results were observed after BALF_IPF stimulation, indicating the significance of myofibroblasts in IPF.

Η Ιδιοπαθής Πνευμονική Ίνωση (IPF/ΙΠΙ) χαρακτηρίζεται από βλάβη του κυψελιδικού επιθηλίου, ρήξη της βασικής μεμβράνης και απορρύθμιση του επουλωτικού μηχανισμού με κυρίαρχο ρόλο να έχουν οι μυοϊνοβλάστες, κύτταρα αποκλειστικά υπεύθυνα για την υπερβολική παραγωγή και εναπόθεση κολλαγόνου στο πνευμονικό παρέγχυμα, που έχει ως αποτέλεσμα την αναδιαμόρφωσή του (remodeling). Αν και τα τελευταία χρόνια υπάρχει εντατική έρευνα σε ότι αφορά την κατανόηση των μηχανισμών που οδηγούν σε αυτή, παραμένουν πολλά ανεξερεύνητα μονοπάτια της παθογένεια της.Σκοπός της παρούσας μελέτης είναι η διερεύνηση του ρόλου των υποεπιθηλιακών μυοϊνοβλαστών του πνεύμονα (ΥΜΠ) και των διαλυτών μεσολαβητικών παραγόντων που επιδρούν στην ενεργοποίησή τους και την ανάπτυξη της ίνωσης σε ασθενείς με ιδιοπαθή πνευμονική ίνωση.Για το σκοπό της μελέτης ελήφθη βρογχοκυψελιδικό έκπλυμα (ΒΚΕ) χρησιμοποιώντας το εύκαμπτο βρογχοσκόπιο με την καθιερωμένη τεχνική από ασθενείς με γνωστή ΙΠΙ βάσει των ισχυόντων διαγνωστικών κριτηρίων (ATS/ERS/JRS/ALAT 2011). Για ομάδα ελέγχου χρησιμοποιήθηκε ΒΚΕ από ασθενείς με ιδιοπαθή μη ειδική διάμεση πνευμονία (iNSIP), πάθηση η οποία ανήκει μεν στις ιδιοπαθείς διάμεσες πνευμονίες, όμως είναι διακριτή ως προς την παθογένεια, την πορεία και θεραπεία της, καθώς και από φυσιολογικά άτομα τα οποία υποβλήθηκαν σε βρογχοσκόπηση για διαγνωστικούς λόγους. Οι ΥΜΠ απομονώθηκαν από χειρουργικά δείγματα υγιούς πνευμονικού ιστού τα οποία στη συνέχεια καλλιεργήθηκαν με προ-φλεγμονώδεις παράγοντες ή με ΒΚΕ από ασθενείς με IPF ή iNSIP και εκτιμήθηκε η ινωτική τους δράση με την δοκιμασία επούλωσης τραύματος, in vitro, με διαδοχική λήψη εικόνων μέσω ανάστροφου μικροσκοπίου Olympus, καθώς και με την παραγωγή κολλαγόνου (μg/mL). H απομόνωση του ολικού RNA έγινε με την χρήση του TRIzol και ο καθαρισμός του με τη χρήση του κιτ DNase I. Η έκφραση των ινωτικών παραγόντων Tissue factor (ΤF) και (TNF-like ligand 1A) TL1A από τους ΥΜΠ έγινε με real time PCR. Παράλληλα μελετήθηκε ο ρόλος των διαλυτών μεσολαβητών IL-1α, TNF-α και IFN-γ είτε μόνων είτε σε συνδυασμό, στην προαγωγή και έκφραση των ινωτικών παραγόντων, ιστικού παράγοντα (tissue factor, TF), TGF-β και TL1A από τους ΥΜΠ. Για την ποσοτικοποίησή τους χρησιμοποιήθηκε η τεχνική της RT-PCR μετά από σύνθεση του cDNA. O χαρακτηρισμός των μυοϊνοβλαστών και η εντόπιση του TL1A έγιναν με την τεχνική του ανοσοφθορισμού. Η έκφραση των ινωτικών παραγόντων TF και TL1A, καθώς και η παραγωγή κολλαγόνου από τους ΥΜΠ έγινε με RT-PCR και Sircol assay, αντιστοίχως. Από την παρούσα μελέτη προέκυψαν τα εξής αποτελέσματα. Διέγερση των ΥΜΠ με ΒΚΕ, ασθενών και μη (n=3), ή μαζί με τη προσθήκη συνδυασμού κυτταροκινών (IL-1α+TNF-α+IFN-γ) υπήρξε στατιστικά σημαντική αύξηση επιπέδου κολλαγόνου (IPF1: 183.99 μg/ml±14.03, p<0.01, IPF2: 118.50 μg/ml±5.04, p<0.05, IPF3: 126.23 μg/ml±2.7, p<0.05 και 3C: 184.72 μg/ml±29.72, p<0.05 σε σύγκριση με τα μη διεγερμένα: 63 μg/ml±1.2). Διέγερση των ΥΜΠ με ΒΚΕ, ασθενών και μη, ή μαζί με προ-φλεγμονώδεις κυτταροκίνες (IL-1α, TNF-α) έδειξε μια στατιστικά σημαντική αύξηση στη μεταγραφική ενεργότητα του TF (IPF: 3.56-fold±0.14, IL-1α: 2.5-fold±0.08, TNF-α: 2.3-fold±0.007, 2C: 2.7-fold±0.17, p<0.05 σε σύγκριση με τα μη διεγερμένα: 1.1-fold±0.3) και TL1A (IPF: 6.5-fold±0.8, IL-1α: 156-fold±14.94, TNF-α: 240-fold±7.8, 2C: 116-fold±3.6, p<0.01 σε σύγκριση με τα μη διεγερμένα: 1.3-fold±0.6). Τα επίπεδα του TL1A επιβεβαιώθηκαν με ανοσοφθορισμό. Είναι η πρώτη φορά που ο TL1A ερευνάται στους ΥΜΠ. Διέγερση των ΥΜΠ μαζί με προ-φλεγμονώδεις κυτταροκίνες δεν επέδειξε κάποια σημαντική αύξηση στη μεταναστευτική ικανότητα σε σύγκριση με αυτή που διεγέρθηκαν με ΒΚΕ (IPF2: 43.69%±2.16, p<0.01, IPF3: 36.49%±2.37, p<0.05).Συμπερασματικά, το BALF από ασθενείς με ΙΠΙ επάγει την ινωτική δραστηριότητα σε μυοϊνοβλάστες πνεύμονα, παρόμοιο με τους μεσολαβητές που σχετίζονται με την ίνωση του πνεύμονα, υποδεικνύοντας έναν βασικό ρόλο των ΥΜΠ στην ΙΠΙ. Η κυτταροκίνη TL1A είναι μία σημαντική ινωτική κυτταροκίνη, που εκλύεται αρκετά στις ινωτικές βλάβες και επιδρά στην ινωτική δραστηριότητα των μυοϊνοβλαστών των ασθενών με ΙΠΙ.