Συνεκτίμηση της συνέχειας της ανοσοϊστοχημικής έκφρασης του αγγειακού ενδοθηλιακού αυξητικού παράγοντα (VEGF) και των εξωκυττάριων δομικών γλυκοπρωτεϊνών κατά την εμβρυϊκή ανάπτυξη του ανθρώπινου σπλήνα

Abstract

Vascular endothelial growth factor (VEGF) is an angiogenic factor, responsible for the de novo angiogenesis from progenitor endothelial cells as well as the angiogene-sis from preexisting vessels. During embryonal development VEGF has a multicomplex role in the gene activation, survival, proliferation, differentiation and migration of dif-ferent types of cells within the fetal spleen. Thus, VEGF seems to be directly or indi-rectly related to the hemopoietic and lymphopoietic functions of the human developing embryonal spleen.Extracellular matrix (ECM) is a dynamic “living” structure composed of a com-plex network of macromolecules that occupies and supports the space between the fibers and the cells, regulates the polarization, migration and communication of cells and func-tions as a local “reservoir” for cellular growth factors. Extracellular matrix glycoproteins are important for ECM structure and stabiliza-tion, as well as for cell surface connections, thus offering important biological infor-mation for the maintenance of the normal morphological and functional properties of a splenic parenchyma.Membrane proteins are parts of gap junctions, which are communication channels between cells and their microenvironment, allowing transportation of signaling mole-cules responsible for vital cellular activities, thus influencing multiple functions of the embryonal spleen. The object of this study was to evaluate the immunocytochemical expression of specific proteins during the different developmental stages of the human fetal spleen, under non-pathological (normal) and pathological conditions such as acute chorioamni-onitis.Acute chorioamnionitis is an acute inflammation of the fital membranes, umbili-cal cord and sometimes of the fetus as well, due to infective microorganisms. It is the most frequent pathologic entity of pregnancy and has been correlated with several en-dometrial fetal deaths. For this reason, we additionally related possible changes on the hemopoietic cells and lymphocytes, in order to estimate the affects of those proteins on hemopoietic and lymphopoietic properties of the fetal spleen.The study included one hundred forty four human fetuses with the respective fe-tal membranes. Thirty six of them came from non pathological cases (control group) and one hundred and eight cases derived from terminated pregnancies due to various de-grees of chorioamnionitis. Conventional histological examination of the fetal membranes was performed. All studies were investigated by specific immunohistochemical markers for VEGF, membrane protein connexin 43, the extracellular matrix components tenascin C and laminin and cells of hemopoietic and lymphopoietic lineage.The present results revealed no major quantitative differencies in the expression of all the above markers by the end of the first trimester, when we compared the control group with the chorioamnionitis groups. On the contrary, we observed significant altera-tions in the second and third trimesters of pregnancy. Specifically, all acute chorioamni-onitis cases revealed a decreased expression of VEGF, connexin 43, tenascin C and lam-inin, with a concurrent increase of the progenitor hemopoietic cells, granulocytic cells and the T-cytotoxic lymphocytes. The number of the remaining cells such as megakaryo-cytes, B-lymphocytes and T-helper lymphocytes was significantly decreased. The above alterations were proportional to the degree of severity (mild, moderate, severe) of the acute inflammation and statistically important (p<0.05). The pathogenetic mechanism responsible for the diminished of the afore men-tioned proteins in the cases of acute chorioamnionitis, seems to be the release of toxic molecules and cytokines that damage and alter the physiological anatomical and func-tional properties of the embryonal spleen, especially during the second and third tri-mesters of pregnancy.Conclusively, we believe that the alterations in the immunocytochemical expres-sion of VEGF, connexin 43, tenascin C and laminin in the cases of acute chorioamni-onitis, reflect the damages induced by the toxic inflammatory metabolites in the anatom-ical/ structural developmental components of the spleen as well as its hemopoietic and lymphopoietic properties. Since limited data have been published so far in the literature regarding the cor-relation of VEGF and connexin 43 impact on the human developing spleen, both in non-pathological and pathological conditions of acute chorioamionitis, we believe that fur-ther studies are required to specify and establish their role.

Ο αγγειακός ενδοθηλιακός αυξητικός παράγοντας VEGF είναι μία γλυκοπρωτεΐνη που αποτελεί τον κύριο ρυθμιστή της αγγειογένεσης, τόσο de novo από πρόδρομα ενδοθηλιακά κύτταρα στο έμβρυο, όσο και από προϋπάρχοντα αγγεία μεταγενέστερα. Κατά την εμβρυική ανάπτυξη ο ρόλος του VEGF είναι πολύπλευρος, καθώς συμμετέχει στην ενεργοποίηση γονιδίων, την επιβίωση, τον πολλαπλασιασμό, τη διαφοροποίηση και τη μετανάστευση διαφόρων τύπων κυττάρων και φαίνεται να σχετίζεται με τις λειτουργίες του σπλήνα ως αιμοποιητικό και ανοσοποιητικό όργανο. Παράλληλα, η εξωκυττάρια ουσία είναι μια δυναμική δομή αποτελούμενη από ένα πολύπλοκο δίκτυο σύνθετων μορίων, που καταλαμβάνει και στηρίζει τον χώρο μεταξύ των ινών και των κυττάρων, ρυθμίζει τη μετακίνηση και την ενδοεπικοινωνία αυτών και παρέχει μια τοπική «αποθήκη» για τους παράγοντες της κυτταρικής ανάπτυξης. Επιπλέον οι πολυσυγκολλητικές γλυκοπρωτεΐνες διαδραματίζουν σημαντικό ρόλο στη δομή και τη σταθεροποίηση της εξωκυττάριας ουσίας, καθώς επίσης και στη σύνδεση με τις επιφάνειες των κυττάρων, προσφέροντας έτσι σημαντικές βιολογικές πληροφορίες στο σπληνικό παρέγχυμα. Οι μεμβρανικές πρωτεΐνες συμβάλουν στη δημιουργία χασματοσυνδέσεων, καναλιών δη-λαδή επικοινωνίας του κυττάρου με το μικροπεριβάλλον του, επιτρέπουν τη διέλευση σηματοδοτικών μορίων και με τον τρόπο αυτό συμμετέχουν σε πολλαπλές ζωτικές κυτταρικές διεργασίες, επηρεάζοντας συνολικά τις λειτουργίες του αναπτυσσόμενου σπλήνα. Ο ερευνητικός σκοπός της παρούσης μελέτης ήταν να αξιολογήσει την έκφραση συγκεκριμένων πρωτεϊνών κατά τα διάφορα στάδια ανάπτυξης του ανθρώπινου εμβρυϊκού σπλήνα υπό φυσιολογικές (μη παθολογικές) συνθήκες και στη συνέχεια να τα συγκρίνει με τις αντίστοιχες ανοσοϊστοχημικές εκφράσεις σε έμβρυα με συνοδές αλλοιώσεις οξείας χοριοαμνιονίτιδας, γνωρίζοντας ότι η συγκεκριμένη παθολογική κατάσταση είναι μία οξεία φλεγμονή των μεμβρανών και του χορίου του πλακούντα, συνήθως λόγω λοιμώξεων από παθογόνους μικροοργανισμούς. Αναφέρεται μάλιστα ως η συχνότερη παθολογική οντότητα της κύησης και σχετίζεται με αρκετούς ενδομήτριους θανάτους. Για τον λόγο αυτό, συσχετίσαμε τη νόσο με τις μεταβολές στα αιμοποιητικά και λεμφικά κύτταρα, για να προσδιορίσουμε την επίδραση των πρωτεϊνών αυτών στην αιμοποιητική και ανοσολογική λειτουργία του οργάνου.Η μελέτη περιελάμβανε εκατόν σαράντα τέσσερα έμβρυα, τριάντα έξι εκ των οποίων προήλθαν από μη παθολογικές διακοπές κύησης και αποτέλεσαν τις ομάδες μαρτύρων, καθώς και από εκατόν οκτώ έμβρυα, προερχόμενα από παθολογικές διακοπές κύησης, πρωτίστως λόγω ποικίλου βαθμού βαρύτητας οξείας φλεγμονής (οξεία χοριοαμνιονίτιδα). Χρησιμοποιήθηκαν ειδικοί ανοσοϊστοχημικοί δείκτες για τον VEGF, για τη μεμβρανική πρωτεϊνη κοννεξίνη 43, για τις δομικές πολυσυγκολλητικές πρωτεϊνες της εξωκυττάριας θεμέλιας ουσίας τενασκίνη C και λαμινίνη καθώς και για τα αιμοποιητικά κύτταρα και λεμφοκύτταρα.Στα αποτελέσματα της μελέτης μας στο 1ου τρίμηνο της κύησης, δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές ποσοτικές διαφορές στην ανοσοϊστοχημική έκφραση του VEGF, της κοννεξίνης 43, της τενασκίνης C και της λαμινίνης στην ομάδα εμβρύων με αλλοιώσεις οξείας φλεγμονής, σε σχέση με την ομάδα μαρτύρων. Αντιστοίχως δεν παρατηρήθηκαν ουσιώδεις μεταβολές στον αριθμό των μεγακαρυοκυττάρων, των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων, των κυττάρων της μυελικής σειράς, των Β-λεμφοκυττάρων, των βοηθητικών Τ-λεμφοκυττάρων και των κυτταροτοξικών Τ-λεμφοκυττάρων. Κατά τη διάρκεια του 2ου και 3ου τριμήνου παρατηρήθηκαν σημαντικές μεταβολές τόσο στην έκφραση των πρωτεϊνών, όσο και στον αριθμό των αιμοποιητικών κυττάρων και λεμφοκυττάρων, στις ομάδες εμβρύων με αλλοιώσεις οξείας χοριοαμνιονίτιδας, συγκρινόμενες πάντα με τις αντίστοιχες ομάδες μαρτύρων. Οι μεταβολές στην έκφραση των πρωτεϊνών αφορούσαν στη σημαντική μείωση έως και πλήρη απώλεια της ανοσοϊστοχημικής έκφρασης. Οι μεταβολές στα αιμοποιητικά κύτταρα έδειξαν σημαντική μείωση του αριθμού των μεγακαρυοκυττάρων, σημαντική αύξηση του αριθμού των αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων και των κυττάρων της μυελικής σειράς, σημαντική μείωση των βοηθητικών Τ-λεμφοκυττάρων και των Β-λεμφοκυττάρων και σημαντική αύξηση των κυτταροτοξικών Τ-λεμφοκυττάρων. Αξίζει να σημειωθεί ότι οι παραπάνω μεταβολές ήταν ανάλογες με τον βαθμό σοβαρότητας της οξείας φλεγμονής και ήταν στατιστικά σημαντικές (p<0.05). Ο παθογενετικός μηχανισμός που είναι υπεύθυνος για τη μείωση της συγκέντρωσης και επομένως και της έκφρασης όλων των παραπάνω παραγόντων στις περιπτώσεις οξείας χοριοαμνιονίτιδας, φαίνεται να είναι η απελευθέρωση τοξικών μορίων, κυτοκινών και ιντερλευκινών, οι οποίες δρουν επιζήμια και μεταβάλλουν τόσο την ανατομική δομή του σπλήνα, όσο και τις λειτουργικές του ιδιότητες ως όργανο αιμοποίησης και ανοσοποίησης, ιδιαίτερα κατά το 2ο και 3ο τρίμηνο εμβρυϊκής ανάπτυξης αντίστοιχα. Επομένως, μπορούμε να συμπεράνουμε ότι οι μεταβολές στην ανοσοϊστοχημική έκφραση του VEGF, της κοννεξίνης 43, καθώς και των εξωκυττάριων δομικών γλυκοπρωτεϊνών τενασκίνης C και λαμινίνης στις περιπτώσεις οξείας χοριοαμνιονίτιδας, αντανακλούν στις διαταραχές που προκαλεί η φλεγμονή αυτή, τόσο στην ανατομική/δομική ανάπτυξη του σπλήνα, όσο και στις αιμοποιητικές και ανοσολογικές λειτουργίες που επιτελεί το όργανο αυτό, στα διάφορα στάδια της εμβρυϊκής ανάπτυξης και ιδιαίτερα κατά τη διάρκεια του 2ου και 3ου τριμήνου.Λόγω των περιορισμένων παρόμοιων μελετών που υπάρχουν για τη συσχέτιση της επίδρασης κυρίως του VEGF και της κοννεξίνης 43 στον ανθρώπινο εμβρυϊκό σπλήνα, τόσο σε φυσιολογικές συνθήκες όσο και σε συνθήκες χοριοαμνιονίτιδας, θεωρούμε ότι περαιτέρω έρευνες, χρειάζεται να διεξαχθούν, για να αποσαφηνιστεί πλήρως ο ρόλος τους.