Μελέτη συστατικών του ενδοκανναβινοειδούς συστήματος σε εγκέφαλο και αιμοπετάλια κουνελιού

Abstract

In the present study, the interaction of rabbit platelets with the endoccannabinoid system was investigated. It was shown that 2-arachidonylglycerol (2-AG) induces platelet aggregation and is degraded in rabbit platelets by the action of the enzymes fatty acid amide hydrolase (FAAH) and monoacylglycrol lipase (MAGL). These enzymes were detected in both rabbit and human platelets using western blotting analysis; FAAH was exclusively found in cell membranes while MAGL was localized in platelet vesicles. Although platelet aggregation by 2-AG has been shown in a number of studies, there are contradictive opinions regarding the involved mechanism. In this study it was shown that in rabbit platelets 2-AG induces aggregation through the arachidonic acid derived from its hydrolysis and interestingly PPARs seem to participate in the aggregation process. PPARγ was detected using western blotting analysis while electron microscopy revealed that it was localized in rabbit and human platelet cytoplasm. In parallel, 2-AG and anandamide hydrolysis in rabbit brain has been studied. Finally, rabbit CB1, CB2, MAGL, FAAH and PPARγ were compared with the respective protein sequences known for other species (human, rat and mouse). In addition, proteins were also detected in the level of mRNA. The role of the endocannabinoid system in the central nervous system and the periphery is prominent and its maintenance throughout the evolution in a variety of species, proves its significance. The incorporation of endocannabinoids and analogs in platelets and their hydrolysis to arachidonic acid and other fatty acids reveal a role of these compounds as a source of intracellular free fatty acids, well known PPAR ligands, among other functions. Furthermore, PPARs involvement in platelet aggregation strengthens the notion that these receptors participate in a number of processes apart from DNA transcription and makes platelets a useful model for studying PPARs.

Κύριο αντικείμενο της παρούσας εργασίας αποτέλεσε η μελέτη της αλληλεπίδρασης συστατικών του ενδοκανναβινοειδούς συστήματος με τα αιμοπετάλια του κουνελιού και η διευκρίνιση του τρόπου δράσης της 2-αραχιδονυλογλυκερόλης (2-AG). Διαπιστώθηκε ότι στα αιμοπετάλια του κουνελιού η 2-AG υδρολύεται με τη δράση των ενζύμων αμιδοϋδρολάση των λιπαρών οξέων (FAAH) και λιπάση των μονοακυλογλυκερολών (MAGL). Τα ένζυμα αυτά ταυτοποιήθηκαν στα αιμοπετάλια κουνελιού και ανθρώπου και βρέθηκε ότι η μεν FAAH εντοπίζεται στις μεμβράνες η δε MAGL σε κυστίδια. Η 2-AG προκαλεί συσσώρευση των αιμοπεταλίων, με αντικρουόμενες απόψεις ως προς το μηχανισμό. Στα αιμοπετάλια κουνελιού η συσσώρευση προκαλείται κυρίως μέσω του αραχιδονικού οξέος που παράγεται από την υδρόλυση της 2-AG, ενώ στη διαδικασία εμπλέκονται και οι πυρηνικοί υποδοχείς PPAR, στους οποίους έχουν τη δυνατότητα σύνδεσης και τα ενδοκανναβινοειδή. Ο PPARγ ταυτοποιήθηκε και διαπιστώθηκε ότι εντοπίζεται στο κυτταρόπλασμα των αιμοπεταλίων κουνελιού και ανθρώπου. Παράλληλο στόχο της διατριβής αποτέλεσε η μελέτη της υδρόλυσης της 2-AG αλλά και του ανανταμιδίου στον εγκέφαλο του κουνελιού. Τέλος, συγκρίθηκαν οι πρωτεΐνες CB1, CB2, MAGL, FAAH και PPARγ του κουνελιού με αυτές του ανθρώπου, του αρουραίου και του ποντικού και πιστοποιήθηκε η ύπαρξή τους και σε επίπεδο mRNA. Η ενσωμάτωση και υδρόλυση των ενδοκανναβινοειδών και αναλόγων ενώσεων από τα αιμοπετάλια αναδεικνύει το ρόλο των ενδοκανναβινοειδών και ως πηγής αραχιδονικού αλλά και άλλων λιπαρών οξέων προσδετών των PPAR ενώ η εμπλοκή των PPAR στη διαδικασία της συσσώρευσης αφενός εδραιώνει την άποψη ότι συμμετέχουν σε ένα πλήθος λειτουργιών που δεν συνδέονται με τη μεταγραφή και αφετέρου καθιερώνει τα αιμοπετάλια ως ένα μοντέλο για τη μελέτη τους.