Ανοσιακή απόκριση υγιών μετά από οξεία έκθεση σε αλκοόλη

Abstract

Introduction: Acute Alcohol exposure is related to increased susceptibility to infections.The purpose of the study was to investigate the effect of acute exposure to alcohol on immune response, via the pro- and anti-inflammatory cytokine production, in an ex-vivo model of whole blood stimulation with lipopolysacharide (LPS). Methods: Whole blood was taken from healthy volunteers and was placed in tubes containing EDTA and immediately transferred to the lab. Whole blood samples were divided in 14 groups: the control group (without any intervention), the LPS group (with LPS alone), and 12 alcohol groups with (6 groups) and without LPS stimulation (6 groups) using six different doses of alcohol (final concentrations 5‚ 12.5‚ 25‚ 50‚ 100 and 200mM). Blood samples were diluted 1:10 in RPMI 1640 culture medium (100 μl whole blood added in 900 μl RPMI 1640). LPS (500 pg) was added after pretreatment with alcohol for 10 minutes according to the study protocol. After incubation period of 4 hours at 37°C, samples were centrifuged (3.000 rpm, 5 minutes, r.t.). Culture supernatants were collected and stored at –80°C until measurements. TNFa, ΙL-6, ΙL-10, sTNFR Ι and sTNFR ΙΙ levels (pg/ml) were determined in culture supernatant using the ELISA method.Results: We studied 24 healthy male volunteers aged 36.5 ± 1.4 (X ± SEM). Alcohol had no effect on cytokine production when incubated with whole blood alone. TNF-α, IL-6 and IL-10 were significantly increased after LPS stimulation, compared to controls. Alcohol had no effect on IL-6 production after LPS challenge, but significantly decreased TNF-α and IL-10 production in the presence of LPS challenge at 25mM to 200mM, in a dose dependent manner, compared to the LPS group. Alcohol had no effect on sTNFR I production when incubated with or without LPS. Alcohol significantly increased sTNFR II levels after LPS stimulation, compared to the control group. Alcohol, when incubated with whole blood alone at lower doses (<50mM), decreased sTNFR II levels, but an increase in sTNFR II levels was observed at the higher doses of 100 and 200mM of alcohol, compared to LPS stimulation, which was statistically significant compared to the costimulated samples with both alcohol, at lower doses, and LPS ex vivo.Conclusions: TNF-α and IL-10 were significantly decreased after acute alcohol exposure, in a dose depended manner, in a model of whole blood stimulation with LPS ex-vivo. Our observations indicate a suppressive effect of alcohol on both pro-inflammatory and anti-inflammatory responses. It was also indicated, that alcohol has a differential effect on sTNFR II production of whole blood in either the presence or the absence of LPS challenge ex-vivo, depending on the alcohol concentration.

Εισαγωγή: Η οξεία έκθεση στην αλκοόλη σχετίζεται με αύξηση της επίπτωσης των λοιμώξεων. Σκοπός της μελέτης: ήταν η διερεύνηση της ανοσιακής απόκρισης στην οξεία έκθεση στην αλκοόλη, μέσω της παραγωγής προ- και αντι-φλεγμονωδών κυτταροκινών, μετά διέγερση ολικού αίματος με LPS ex-vivo.Μέθοδος: Τα δείγματα ολικού αίματος ελήφθησαν από υγιείς εθελοντές, τοποθετήθηκαν σε σωληνάρια με EDTA και μεταφέρθηκαν άμεσα στο εργαστήριο. Τα δείγματα χωρίστηκαν σε 14 ομάδες: την ομάδα ελέγχου (καμία παρέμβαση), την ομάδα της LPS (προσθήκη μόνον LPS) και 12 ομάδες αλκοόλης με και χωρίς LPS, με προσθήκη έξι διαφορετικών δόσεων αλκοόλης (τελικές συγκεντρώσεις: 5‚ 12.5‚ 25‚ 50‚ 100 και 200mM). Tα ηπαρινισμένα δείγματα του ολικού αίματος αραιώθηκαν 1:10, σε καλλιεργητικό μέσο RPMI 1640 (100μl από το κάθε δείγμα αίματος προστέθηκαν σε 900 μl RPMI 1640). Έγινε προσθήκη LPS (500pg) μετά 10 λεπτά από την προσθήκη της αλκοόλης, σύμφωνα με το πρωτόκολλο της μελέτης. Ακολούθησε επώαση των δειγμάτων για 4 ώρες στους 37° C. Στη συνέχεια έγινε φυγοκέντρηση (3.000rpm για 5min σε Θ.Δ.) και επακολούθησε διαχωρισμός του υπερκείμενου ορού, που διατηρήθηκε στους -80° C μέχρι να γίνουν οι μετρήσεις. Στο υπερκείμενο του αίματος των δειγμάτων προσδιορίστηκαν οι συγκεντρώσεις (pg/ml) των: TNF-a, ΙL-6, ΙL-10, sTNFR Ι και sTNFR ΙΙ, με τη μέθοδο ELISA.Αποτελέσματα: Μελετήθηκαν 24 υγιείς άνδρες εθελοντές ηλικίας 36.5 ± 1.4 (X ± SEM). Η αλκοόλη από μόνη της δεν είχε καμία επίδραση στην παραγωγή κυτταροκινών. Τα επίπεδα του TNF-α, της IL-6 και της IL-10 αυξήθηκαν σημαντικά μετά από διέγερση με LPS, συγκριτικά με την ομάδα ελέγχου. Η προσθήκη αλκοόλης δεν επηρέασε την παραγωγή της IL-6 μετά από διέγερση με LPS. Προκάλεσε όμως δοσοεξαρτώμενη μείωση της παραγωγής του TNF-α και της IL-10 σε συγκεντρώσεις 25mM έως 200mM σε σχέση με τη διέγερση με LPS. Η αλκοόλη δεν είχε επίδραση στην παραγωγή του sTNFR I με ή χωρίς διέγερση με LPS. Η διέγερση με LPS ex-vivo προκάλεσε στατιστικά σημαντική αύξηση των επιπέδων του sTNFR II, συγκριτικά με την ομάδα ελέγχου. Η αλκοόλη σε μικρές συγκεντρώσεις(<50mM) φάνηκε να προκαλεί μείωση των επιπέδων του sTNFR II. Αύξηση των επιπέδων του sTNFR II παρατηρήθηκε σε μεγαλύτερες συγκεντρώσεις αλκοόλης, που ήταν στατιστικά σημαντική σε συγκεντρώσεις αλκοόλης 100mM και 200mM μετά από διέγερση με LPS ex vivo συγκριτικά με τα δείγματα, που έγινε συνδιέγερση με μικρές συγκεντρώσεις αλκοόλης και LPS. Συμπεράσματα: Η οξεία έκθεση στην αλκοόλη προκάλεσε με δοσοεξαρτώμενο τρόπο στατιστικά σημαντική μείωση της παραγωγής TNF-α και IL-10 στο ολικό αίμα μετά διέγερση με LPS ex-vivo. Οι παρατηρήσεις μας δείχνουν ότι η αλκοόλη διαθέτει κατασταλτική δράση τόσο στην προφλεγμονώδη όσο και στην αντιφλεγμονώδη απόκριση. Επίσης, διαπιστώθηκε ότι η αλκοόλη έχει διαφορική δράση στην παραγωγή των sTNFR II στο ολικό αίμα με ή χωρίς διέγερση με LPS ex-vivo, που εξαρτάται από τη συγκέντρωση της αλκοόλης.