Ανοσοϊστοχημική μελέτη σε επίμυες των γονιδίων NEU και N-RAS που συσχετίζονται με τους μηχανισμούς ογκογένεσης στη στοματική κοιλότητα

Abstract

Oral squamous cell carcinoma (OSCC) is the sixth most common cancer worldwide and the overall survival rates have not improved in the past years. Oral oncogenesis is a multi-step process including multiple molecular genetic events that involve aberrant expression of oncogenes and inactivation of tumour suppressor genes. The accumulation of such genetic events seems to contribute to uncontrolled cell growth and formation of invasive carcinomas through progressive histological stages. However, the precise nature of the genetic alterations occurring at each step of oral carcinogenesis remains unclear. Hence, the elucidation of the molecular lesions involving oncogenes in oral oncogenesis would contribute to a better understanding of this disease, an earlier diagnosis and a more successful treatment. Purpose: This study was designed to determine the gradual expression of the oncogenes neu/erbB2/HER2 and N-ras and their feasible correlation in an experimental model of chemically induced oral carcinogenesis in Syrian golden hamsters. Materials and Methods: Thirty-seven male Syrian golden hamsters were divided into three experimental groups (A,B,C;10 animals each) and one control group (7 animals). The left buccal pouches of animals in groups A, B and C were painted three times per week for 14 weeks with carcinogen 0.5% 9,10-dimethyl-1,2-benzanthracene (DMBA) and were excised at 10, 14, 19 weeks respectively. The left buccal pouch of control animals was excised following a ten-week period without carcinogen application. The biopsies were classified pathologically (normal mucosa, hyperkeratosis, hyperplasia, dysplasia, early invasion, well and moderately differentiated carcinoma) and were studied using monoclonal antibodies against c-erbB2 and N-ras. There was an evaluation of the entire section and of the histological grades in each section. The two-tailed Student’s test was performed for each animal group and for each histological categoryResults: The histological status of the observed lesion in the three experimental groups corresponded well with tumour advancement. A gradual increase of erbB2 expression from oral mucosa to non-cancerous and precancerous stages was observed. In the initial tumour stages the percentages of positively erbB2 stained cells remained almost stable, while in the moderately differentiated carcinoma a substantial decrease was observed. Interestingly, the erbB2 cytoplasmic staining was very elevated compared to membrane staining in the initial stages of oral oncogenesis, while both of them decreased during the later stages of oral oncogenesis. A similar pattern of initial increase and stabilization of erbB2 expression was revealed for the control group and the three experimental groups. The expression of N-ras gradually decreased during oral carcinogenesis. Statistically significant differences were observed in the dysplastic oral tissues compared to normal oral mucosa, as well as in well differentiated and moderately differentiated carcinomas compared to precancerous lesions. The comparison of the animal groups revealed a statistically significant decrease of N-ras only between experimental groups C and B. The observed patterns of erbB2 and N-ras expression do not seem to correlate. Conclusions : There is a strong correlation between erbB2 overexpression and oral cancer progression. Cytoplasmic erbB2 expression was gradually increased in precancerous stages, remained stable in initial tumour stages and substantially decreased in moderately differentiated carcinomas, suggesting that it may be useful as an early prognostic factor. In this animal model a gradual decrease of N-ras expression is monitored. A different signalling pathway, not involving N-ras, may be implicated in the pathogenesis of OSCC. The N-ras expression is not affected by the quantity of erbB2 protein during oral oncogenesis. Therefore, the existing pathway implicating these proteins may be somehow altered in oral cancer.

Σο ακανθοκυτταρικό καρκίνωμα της στοματικής κοιλότητας είναι ο έκτος πιο συχνός καρκίνος σε παγκόσμια κλίμακα και το ποσοστό της συνολικής επιβίωσης δεν έχει βελτιωθεί τα τελευταία χρόνια. Η στοματική ογκογένεση είναι μία πολυσταδιακή διαδικασία, η οποία αποδίδεται σε πολλαπλά μοριακά γεγονότα, που περιλαμβάνουν ανώμαλη έκφραση ογκογονιδίων και απενεργοποίηση ογκοκατασταλτικών γονιδίων. Η συσσώρευση αυτών των γενετικών μεταβολών φαίνεται ότι συμβάλλει στον ανεξέλεγκτο κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την εμφάνιση διηθητικών καρκινωμάτων, μέσω διαδοχικών ιστοπαθολογικών σταδίων. Ωστόσο, η ακριβής φύση των γενετικών μεταβολών σε κάθε στάδιο της στοματικής ογκογένεσης δεν έχει καθοριστεί ακόμη. Επομένως η αποσαφήνιση των μοριακών μεταβολών των ογκογονιδίων που εμπλέκονται στη στοματική ογκογένεση θα συμβάλλει στην καλύτερη κατανόηση αυτής της νόσου, σε μια πιο πρώιμη διάγνωση και μια πιο επιτυχή θεραπεία. Σκοπός: Αυτή η διατριβή εκπονήθηκε με σκοπό να καθοριστεί η σταδιακή έκφραση των ογκογονιδίων neu και Ν-ras και η πιθανή συσχέτισή τους σε ένα πειραματικό πρότυπο χημικής στοματικής ογκογένεσης στον παρειακό μάρσιπο των Syrian golden hamstersΤλικό και Μέθοδος: 37 αρσενικά Syrian golden hamsters ταξινομήθηκαν σε τρεις πειραματικές ομάδες (A,B,Γ;10 πειραματόζωα η καθεμία) και μία ομάδα ελέγχου (7 πειραματόζωα). Έγιναν επαλείψεις στον αριστερό παρειακό μάρσιπο των πειραματόζωων στις ομάδες A, B και Γ τρεις φορές την εβδομάδα για 14 εβδομάδες με το καρκινογόνο 0.5% 9,10-διμέθυλ-1,2-βενζανθρακένιο (DMBA), ο οποίος αφαιρέθηκε χειρουργικά στις 10, 14 και 19 εβδομάδες αντίστοιχα. Ο αριστερός παρειακός μάρσιπος στα πειραματόζωα της ομάδας ελέγχου αφαιρέθηκε μετά από μία περίοδο 10 εβδομάδων χωρίς την εφαρμογή καρκινογόνου. Οι βιοψίες ταξινομήθηκαν ιστοπαθολογικά (φυσιολογικός βλεννογόνος, υπερκεράτωση, υπερπλασία, δυσπλασία, πρώιμη διήθηση, καλά και μέτρια διαφοροποιημένο καρκίνωμα) και εκτιμήθηκαν ανοσοϊστοχημικά με τη χρήση μονοκλωνικών αντισωμάτων, όσον αφορούσε στην έκφραση των πρωτεϊνών neu και Ν-ras . Έγινε εκτίμηση ολόκληρης της τομής και των ιστολογικών κατηγοριών που διακρίθηκαν σε κάθε τομή. Πραγματοποιήθηκε στατιστική ανάλυση σε κάθε ομάδα και σε κάθε ιστολογική κατηγορία, χρησιμοποιώντας το two-tailed Student’s test. Αποτελέσματα: Η ιστολογική κατάσταση των μακροσκοπικών βλαβών στις 3 πειραματικές ομάδες ανταποκρινόταν καλώς στην εξέλιξη του όγκου. Παρατηρήθηκε σταδιακή αύξηση της έκφρασης της erbB2 ήδη από τις υπερκερατωσικές και προκαρκινικές βλάβες. ΢τα αρχικά καρκινικά στάδια τα ποσοστά των κυττάρων με θετική χρώση erbB2 παρέμειναν σχεδόν σε σταθερά επίπεδα, ενώ στο μέτρια διαφοροποιημένο καρκίνωμα παρατηρήθηκε σημαντική μείωση. Eίναι ενδιαφέρον ότι η κυτταροπλασματική χρώση της erbB2 ήταν σε υψηλότερα επίπεδα σε σχέση με τη μεμβρανική χρώση στα αρχικά στάδια της στοματικής ογκογένεσης, ενώ και οι δυο μειώθηκαν κατά τα όψιμα στάδια της στοματικής ογκογένεσης. Παρόμοιο πρότυπο αρχικής αύξησης και σταθεροποίησης της έκφρασης της erbB2 παρατηρήθηκε και στις πειραματικές ομάδες. Η έκφραση της πρωτεΐνης N-ras μειώθηκε σταδιακά κατά τη στοματική ογκογένεση. ΢τατιστικά σημαντικές διαφορές παρατηρήθηκαν στις δυσπλαστικές βλάβες σε σύγκριση με το φυσιολογικό βλεννογόνο, καθώς επίσης στο καλά και μέτρια διαφοροποιημένο καρκίνωμα σε σύγκριση με τις προκαρκινικές βλάβες. ΢τις πειραματικές ομάδες παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική μείωση της N-ras μόνο μεταξύ των ομάδων Β και Γ. Δεν διαπιστώθηκε συσχέτιση των προτύπων έκφρασης των erbB2 και N-ras στα διάφορα στάδια της στοματικής ογκογένεσης.΢υμπεράσματα: Παρατηρείται ισχυρή συσχέτιση της υπερέκφρασης erbB2 και της σταδιακής στοματική ογκογένεσης. Η κυτταροπλασματική έκφραση της erbB2 αυξήθηκε σταδιακά στα προκαρκινικά στάδια, ενώ παρέμεινε σταθερή στα αρχικά καρκινικά στάδια, γεγονός που υποδηλώνει ότι μπορεί να αποτελεί χρήσιμο πρώιμο προγνωστικό δείκτη. ΢ε αυτό το πειραματικό πρότυπο, καταγράφεται σταδιακή μείωση της έκφρασης της N-ras. Ένα άλλο σηματοδοτικό μονοπάτι, που δεν περιλαμβάνει την N-ras, φαίνεται να εμπλέκεται στην παθογένεια του ΑΚ΢Κ. Η έκφραση N-ras δεν επηρεάζεται από την υπερέκφραση της πρωτεΐνης erbB2 κατά την εξέλιξη του καρκίνου του στόματος. Επομένως, η οδός που εμπλέκει αυτές τις δύο πρωτεΐνες μπορεί να έχει μεταβληθεί κατά κάποιο τρόπο στον καρκίνο του στόματος.