Η συμβολή της προεμφυτευτικής διάγνωσης αριθμητικών χρωμοσωμικών ανωμαλιών στην υποβοηθούμενη αναπαραγωγή

Abstract

Chromosome aneuploidy is a major cause of pregnancy failure and loss and is detected in 50% of first trimester spontaneous miscarriages (Hassold and Hunt, 2001; Spandorfer et al., 2004). 70% of chromosome aneuploidy mostly involves chromosomes 13, 22, 16, 18, 21, 15, X and Y. Aneuploidy rates is higher in embryos (70%) from in vitro fertilization cycles (IVF) compared to spontaneous miscarriages. This implies that embryos in IVF with aneuploidies might be rejected before or after embryotransfer, thus reducing implantation frequency. For this reason, preimplantation genetic screening (PGS) of human embryos following IVF, by either polar body or cleavage stage embryo biopsy and fluorescence in situ hybridisation (FISH) of 5-9 chromosome specific probes to the single metaphase or interphase nuclei, had, until recently, been used extensively in women of advanced maternal age and other indications associated with a higher incidence of aneuploidy (Verlinsky et al., 1996; Munne et al., 2002). The aim of PGS is to select embryos with normal copy number of chromosomes in order to transfer and thereby increase implantation and clinical pregnancy rates, reduce the incidence of miscarriage and avoid abnormal pregnancies and live births. In the current thesis the first aim was to standardise the protocol for nucleus fixation at the level of a single cell in order to clinically use it in preimplantation genetic diagnosis for aneuploidy screening. 50 embryos, at cleavage stage, were donated to research by consent from patients undergoing in vitro fertilization treatment (IVF). Modified Tarkowski’s protocol (1966) with Carnoy’s (3:1 methanol:acetic acid) was selected as clinically advanced method since it resulted in nuclei with larger diameter and less percentage of cross hybridization FISH signals compared to Coonen et al., (1994) protocol with Tween-20 HCl. Following fixation of single cells with the most appropriate method, FISH was selected as the method of chromosome analysis since it can be applied efficiently in interphase nuclei. FISH analytical sensitivity and specificity was estimated at 83.3% and 91% respectively, by analyzing 34 embryos at cleavage stage. Misdiagnosis rate due to technical issues was calculated at 3%. Furthermore, mosaicism rate at cleavage was estimated at 8.37% and the risk of classifying an embryo as aneuploid or euploid and vice versa due to mosaicism was 6.37% and 2% respectively.During the second phase of the current thesis 4442 embryos and blastomeres from a consecutive series of controlled ovarian stimularion cycles were analyzed for their chromosome complement by FISH. To investigate the concordance rate and the accuracy of single blastomere analysis at the chromosomal level, a detailed retrospective analysis of 496 embryos at blastocyst stage, that were either estimated as aneuploid or euploid but with poor development, was perfomed. Chromosome follow up of embryos revealed a 3.7% false positive and 14.6% false negative rate for single cell analysis. Τest accuracy regarding representation of the exact embryo chromosome complement was low, predominantly due to mosaicism. Therefore, among reanalyzed embryos only 34.3% (154/449) had identical genotypes between day 3 and day 5 of development. Consequently, accurate copy number analysis of all 24 chromosomes in single blastomeres was performed with microarray based comparative genomic hybridisation (array CGH) in 226 and 121 embryos at cleavage stage from patients with normal and structural abnormalities in their karyotype respectively. Misdiagnosis due to techniqal issues was significantly higher when FISH (11.4%) was applied compared to arrayCGH (4.5%). Normal/balanced embryos frequency in patients with balanced translocations was not significantly different between the two sexes of carriers. However, clinical pregnancy rate was increased in case of female carriers (♀ 12/26, 46%, ♂ 9/22, 41%) but non significantly, which can be attributed to the possible effect of balanced translocations to male fertility. Overall, 2:2 alternative and adjacent-1 were the predominant modes of chromosome segregation in the first meiotic division. 3:0 type of chromosome segregation was extremely rare. 2:2 alternate type of segregation frequency, that generates normal/balanced gametes, was decreased when acrocentric chromosomes were involved in translocation which could be due to the fact that acrocentric chromosomes are less stable than meta- and submetacentric chromosomes throughout chromosome segregation in meiosis. Finally, polar body biopsy and analysis was perfomed with the advantages of being less invasive, since polar bodies do not contribute to the developing embryo, and avoid any possible diagnostic errors caused by chromosomal mosaicism at later stages of preimplantation development. Chromosomes were analyzed in 104 polar bodies in order to detect the ploidy status in the reflecting oocyte. To investigate the concordance rate and the accuracy of polar body analysis at the chromosomal level, we report here a detailed retrospective analysis of copy number changes detected by array CGH in the first (PB1) and second polar body (PB2) and corresponding cleavage stage embryos. Euploid/aneuploid status of polar bodies was efficient in detecting maternally derived aneuploidies in the corresponding embryo at cleavage stage as detetced by reanalysing 30 of the 52 analysed oocytes. Detection rate of aneuploidies of maternal origin were detected at 68 out of 69 (98.5%) copy number changes. However, 17/100 (17%) copy number changes in the polar bodies of these embryos had to be categorised as unclassified segregation errors since they did not predict the outcome in the corresponding embryo accurately, mainly in PB1 and possibly due to artefacts of whole genome amplification from single cells. Analysis of segregation error pattern of the chromosomes in the two polar bodies and corresponding zygote, demonstrated that almost all errors in first meiotic division are caused by premature predivision of sister chromatids rather than non-disjunction of whole chromosomes and many oocytes have multiple meiotic errors. This is consistent with increasing evidence that meiosis specific cohesins which bind the homologuous chromosomes together in oocytes arrested in prophase in the fetal ovary before birth, do not turn over and may be gradually degraded. Also, because half of the MI errors were balanced in the second (MII), the proportion of maternal aneuploidies in embryos originating in MI was much less than MII. In this small series of embryos, there were almost twice as many gains as losses in PB2 resulting in an excess of monosomies in the corresponding embryos.In a specific case of a female carrier of balanced and reciprocal translocation array CGH analysis of the first (PB1) and second polar bodies (PB2) and follow up of the corresponding cleavage stage embryos showed that in 55% of analysed oocytes unbalanced segregation of the translocation chromosomes in the first meiotic division was balanced in the second by the reverse pattern of gain and loss resulting in balanced embryos. Therefore, aneuploidy testing of both polar bodies is essential for accurate prediction of translocation chromosome imbalance in the corresponding embryo.In conclusion:Α) Single cell chromosomal analysis by FISH at cleavage stage could detect aneuploidy but not the exact genotype of an embryo at cleavage. Β) Misdiagnosis due to techniqal issues was significantly higher when FISH was applied compared to arrayCGH at single cell level. C) The frequency of balanced/normal embryos did not differ between two sexes of carriers with structural chromosome abnormalities in their karyotype. However, the clinical pregnancy rates were higher for the female rather than male carriers and this could be attributed to possible effect of translocation to male fertility. The most frequent mode of segregation was the 2:2 alternative type. The rate of balanced/ normal embryos was decreased when translocations involved acrocentric chromosomes and this could be attributed to the fact that acrocentrics are less stable than metacentric and submetacentric chromosomes during meiosis. The rate of balanced/ normal embryos was not decreased when the breakpoints were close to telomeres.D) Aneuploidy testing of both polar bodies is essential for accurate prediction of translocation chromosome imbalance and sporadic aneuploidies in the corresponding embryo. Follow up of embryos at cleavage stage after polar body analysis revealed that aneuploidies detected at polar body biopsy were confirmed in the majority (98.5%) of the corresponding embryos. However, 17/100 (17%) of specific chromosome copy number changes identified at polar bodies were not detected at the corresponding embryos which should be mentioned when counseling patients undertaking aneuploidy screening of their polar bodies. Close inspection of the array CGH plots revealed that many of these unclassified errors involved copy number changes which, by comparison with the ratio for the X chromosome versus sex mismatched control male DNA, were smaller than expected for either whole chromosome or chromatid imbalance. These small copy number changes are likely to be artefacts of whole genome amplification from single cells and therefore should not be reported.Ε) Almost all errors in the first meiotic division are caused by pre-mature pre-division of sister chromatids and not non-disjunction of whole chromosomes and many oocytes have multiple meiotic errors. This is consistent with increasing evidence that meiosis specific cohesins which bind the homologous chromosomes together in oocytes arrested in prophase in the fetal ovary before birth, do not turn over and may be gradually degraded. This is likely to be as a result of the prolonged arrest of the chromosomes at the dictyotene stage of first meiosis.F) Therefore polar body biopsy and analysis of 23 pairs of chromosomes with arrayCGH predicts which oocytes will most probably lead to either nonviable or viable embryos which can lead to miscarriages with complex and single chromosome abnromalities respectively. This will assist in counselling of women about the possibility of a viable pregnancy in subsequent IVF cycles with their own oocytes. Thus, polar body biopsy and array CGH analysis is efficient as it predicts most aneuploidies at cleavage stage embryos. However, whether this method can be an alternative way of analysis is unclear and randomised multicenter prospective studies are needed in order to determine whether current method of analysis performed in this actual study can increase clinical pregnancy rates.

Oι αριθμητικές χρωμοσωμικές ανωμαλίες (ανευπλοειδίες) εντοπίζονται στο 50 % των αυτόματων αποβολών του πρώτου τριμήνου στον άνθρωπο, οι περισσότερες από τις οποίες (70%) αφορούν στα χρωμοσώματα Χ, Υ, 13, 22, 16, 18, 21 και 15 (Hassold and Hunt, 2001;) (Spandorfer, Davis et al. 2004). Στην εξωσωματική γονιμοποίηση (Ιn vitro fertilization-IVF), το ποσοστό των ανευπλοειδιών στα έμβρυα, την τρίτη μέρα της in vitro ανάπτυξης τους, είναι συχνότερο (70%) από ότι στις αυτόματες αποβολές. Το γεγονός αυτό υποδηλώνει ότι έμβρυα που προκύπτουν με εξωσωματική γονιμοποίηση και παρουσιάζουν αριθμητικές χρωμοσωμικές ανωμαλίες απορρίπτονται αυτόματα λίγο πριν ή μετά την μεταφορά τους στη μήτρα, μειώνοντας τα ποσοστά εμφύτευσης (Verlinsky et al., 1996; Munne et al., 2002). Για το λόγο αυτό, η έγκαιρη διάγνωση και ο αποκλεισμός των ανευπλοειδικών εμβρύων από τη μεταφορά τους στη μήτρα της γυναίκας, που υποβάλλεται σε κύκλο τεχνητής γονιμοποίησης, μπορούν να βελτιώσουν τα ποσοστά κύησης. Επιπρόσθετα, η προεμφυτευτική γενετική διάγνωση σε έμβρυα φορέων ισοζυγισμένων μεταθέσεων συντελεί στην αποφυγή μιας παθολογικής κυήσεως.Αρχικά, ο σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η τυποποίηση της μεθοδολογίας μονιμοποίησης πυρήνα στο επίπεδο του ενός κυττάρου έτσι ώστε να μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τους σκοπούς της προεμφυτευτικής διάγνωσης χρωμοσωμικών ανωμαλιών. Για την ανάπτυξη της μεθοδολογίας χρησιμοποιήθηκαν 50 προέμβρυα στο στάδιο της αυλάκωσης τα οποία παραχωρήθηκαν στην έρευνα ύστερα από ενυπόγραφη συγκατάθεση ζευγαριών που υποβάλλονται σε κύκλους εξωσωματικής γονιμοποίησης. Το τροποποιημένο πρωτόκολλο του Tarkowski (Tarkowski and Wronska-Nofer 1966) με τη χρήση Carnoy’s (3:1 μεθανόλη:οξικό οξύ) επιλέχθηκε για να εφαρμοστεί κλινικά ως αρτιότερο, επειδή οι πυρήνες που μονιμοποιήθηκαν είχαν μεγαλύτερη διάμετρο και μικρότερο ποσοστό επικαλυπτόμενων σημάτων FISH, σε σχέση με το πρωτόκολλο κατά Coonen (Coonen, Dumoulin et al. 1994) με Tween-20 HCl. Μετά τον καθορισμό των πειραματικών παραμέτρων για τη μονιμοποίηση του ενός κυττάρου εφαρμόστηκε η τεχνική του φθορίζοντα in situ υβριδισμού (FISH) για τη χρωμοσωμική ανάλυση επειδή μπορεί να εφαρμοστεί σε μεσοφασικούς πυρήνες. Η αναλυτική ευαισθησία και η ειδικότητα της τεχνικής του φθορίζοντα in situ υβριδισμού (FISH) εξετάστηκε σε 34 προέμβρυα και ανήλθε στο 83.3% και 91%, αντίστοιχα. Το ποσοστό λανθασμένης διάγνωσης λόγω τεχνικού προβλήματος ήταν 3%. Ο μωσαϊκισμός στο στάδιο της αυλάκωσης υπολογίσθηκε στο 8.37% με αποτέλεσμα να υπάρχει κίνδυνος να χαρακτηριστεί ένα παθολογικό έμβρυο ως φυσιολογικό ή το αντίστροφο.Στη δεύτερη φάση μελετήθηκαν 4442 έμβρυα και αντίστοιχα βλαστομερίδια, χρησιμοποιώντας την τεχνική του FISH. Από τα 4442 έμβρυα που αναλύθηκαν τα 496 κρίθηκαν ακατάλληλα για εμβρυομεταφορά ύστερα από τον έλεγχο στο στάδιο της τρίτης ημέρας μετά τη γονιμοποίηση και επανεξετάσθηκαν την πέμπτη ημέρα προκειμένου να υπολογισθεί η αποδοτικότητα της μεθοδολογίας. Η επανεξέταση, στο στάδιο της βλαστοκύστης, έδειξε ότι 14.6% και 3.7% των εμβρύων διαγνώστηκαν ψευδώς ως ευπλοειδικά και ανευπλοειδικά αντίστοιχα ύστερα από την ανάλυση του ενός κυττάρου. Παράλληλα, οι συγκεκριμένες χρωμοσωμικές ανωμαλίες που ανιχνεύθηκαν στο στάδιο της αυλάκωσης επιβεβαιώθηκαν μόλις στο 34% των εμβρύων στο στάδιο της βλαστοκύστης. Ο μωσαϊκισμός αποτέλεσε τη σημαντικότερη δυσκολία στην εξαγωγή έγκυρων αποτελεσμάτων κατά την ανάλυση του ενός κυττάρου. Για το λόγο αυτό τα έμβρυα με ‘’καρυότυπο’’ ταυτόσημο με αυτόν που ανιχνεύθηκε στον προεμφυτευτικό έλεγχο στο επίπεδο του ενός κυττάρου, ήταν λίγα. Στη τρίτη φάση της μελέτης εξετάστηκαν 347 έμβρυα τρίτης ημέρας εκ των οποίων τα 121 προήλθαν από άτομα με δομικές χρωμοσωμικές ανωμαλίες στον καρυότυπο με την τεχνική των μικροσυστοιχιών DNA (arrayCGH) για την ανάλυση του συνόλου των χρωμοσωμάτων (Gutierrez-Mateo, Colls et al. 2011). Από τη σύγκριση των δυο μεθοδολογιών χρωμοσωμικής ανάλυσης (FISH και arrayCGH), το περιθώριο λάθους λόγω τεχνικού σφάλματος ήταν σημαντικά μεγαλύτερο στην περίπτωση της εφαρμογής του FISH (11.4%) σε σχέση με το arrayCGH (4.5%). Η συχνότητα των φυσιολογικών εμβρύων στους φορείς ισοζυγισμένων μεταθέσεων δεν ήταν σημαντικά διαφορετική ανάμεσα στα δυο φύλα, αν και τα ποσοστά κλινικών κυήσεων ήταν μεγαλύτερα στην περίπτωση που οι φορείς ήταν γυναίκες (♀ 12/26, 46%, ♂ 9/22, 41%), πιθανώς λόγω της επίδρασης των ισοζυγισμένων μεταθέσεων στην ανδρική γονιμότητα. Συνολικά, ο 2:2 εναλλασσόμενος και ο παρακείμενος-1 ήταν οι κυρίαρχοι τύποι κατά το διαχωρισμό των χρωμοσωμάτων στην πρώτη μειωτική διαίρεση. Ο διαχωρισμός 3:0 ήταν ο σπανιότερος. Η συχνότητα του 2:2 εναλλασσόμενου διαχωρισμού που οδηγεί σε φυσιολογικούς γαμέτες ήταν μικρότερη όταν στις αμοιβαίες και ισοζυγισμένες μεταθέσεις εμπλέκονταν ακροκεντρικά χρωμοσώματα, γεγονός που οφείλεται στο ότι τα ακροκεντικά είναι λιγότερο σταθερά από τα μετα- και υπομετακεντρικά χρωμοσώματα κατά τη διάρκεια διαχωρισμού τους στη μείωση. Παράλληλα, προς αποφυγή της λανθασμένης διάγνωσης λόγω του μωσαϊκισμού εξετάστηκε η ακρίβεια της χρωμοσωμικής ανάλυσης σε 104 πολικά σωμάτια ως προς το επίπεδο της αντιπροσώπευσης της ευπλοειδίας/ανευπλοειδίας του εμβρύου. Η χρωμοσωμική ανάλυση των πολικών σωματίων έδειξε ότι είναι ένας αποτελεσματικός τρόπος ανίχνευσης ανευπλοειδιών μητρικής προέλευσης που προκύπτουν στη μείωση. Η επανεξέταση των 30 εκ των 52 αναλυθέντων ωαρίων έδειξε ότι αξιολογήθηκαν αληθώς ως ανευπλοειδικά βάσει της χρωμοσωμικής ανάλυσης των πολικών σωματίων. Συγκεκριμένα ανιχνεύθηκαν 74 συνολικά ανευπλοειδίες εκ των οποίων οι 29 ήταν τρισωμίες και οι 45 μονοσωμίες. Οι 69 από αυτές (69/74, 93%) σχετίστηκαν με χρωμοσωμικές αλλαγές στα πολικά σωμάτια και θεωρήθηκαν μητρικής προέλευσης ενώ οι 5 (7%) που δεν ανιχνεύθηκαν στα πολικά σωμάτια θεωρήθηκαν πατρικής ή μιτωτικής προέλευσης. Οι 68 από τις 69 (98.5%) ανευπλοειδίες μητρικής προέλευσης για συγκεκριμένα χρωμοσώματα επιβεβαιώθηκαν στα 30 επανεξεταζόμενα έμβρυα.Εντούτοις, οι ανευπλοειδίες συγκεκριμένων χρωμοσωμάτων που δεν ανιχνεύθηκαν στα πολικά σωμάτια αποτέλεσαν το 17% των επανεξεταζόμενων εμβρύων, γεγονός που αποδόθηκε κυρίως σε λάθη κατά τον πολλαπλασιασμό ολόκληρου του γονιδιώματος. Το γεγονός αυτό καταδεικνύει την αναγκαιότητα βελτίωσης της τεχνικής arrayCGH για την αρτιότερη εφαρμογή της σε κλινικό επίπεδο.Ο πρώιμος διαχωρισμός των αδελφών χρωματίδων ήταν ο συχνότερος τύπος (37/38, 97%) που οδήγησε σε ανευπλοειδία στη πρώτη μειωτική διαίρεση, γεγονός που πιθανά να οφείλεται στην αδυναμία ενεργοποίησης και τον σταδιακό εκφυλισμό των συγκολλητίνων-cohesins- σύμπλεγμα πρωτεϊνών που συνδέει τα ομόλογα χρωμοσώματα των ωαρίων κατά το στάδιο της πρόφασης στην εμβρυϊκή ωοθήκη πριν τη γέννηση. Η επανεξέταση των εμβρύων έδειξε ότι το 50% του πρώιμου διαχωρισμού των αδελφών χρωματίδων στην πρώτη μειωτική διαίρεση (MI) ισοζυγίσθηκαν στη δεύτερη (MII) (19/37,51%) οδηγώντας σε ευπλοειδικά έμβρυα. Στη συγκεκριμένη μελέτη το ποσοστό των διπλασιασμών ήταν διπλάσιο σε σύγκριση με τα ελλείμματα των χρωματίδων στο δεύτερο πολικό σωμάτιο (PB2) οδηγώντας σε αύξηση των μονοσωμιών στα αντίστοιχα έμβρυα στο στάδιο της αυλάκωσης.Αναλύοντας τα δυο πολικά σωμάτια στα γονιμοποιημένα ωάρια γυναίκας που έφερε ισοζυγισμένη και αμοιβαία μετάθεση στον καρυότυπο φάνηκε ότι το πρώτο (PB1) και το δεύτερο πολικό σωμάτιο (PB2) ήταν μη ισοζυγισμένα και αντίστροφα ως προς τη μετάθεση στο 55% των αναλυθέντων ωαρίων. Το εύρημα αυτό δεν έχει βιβλιογραφική παραπομπή και είναι αποτέλεσμα μονού αριθμού χιασμάτων σε κοντινό στη μετάθεση τμήμα του ενός χρωμοσώματος κατά τον εναλλασσόμενο ή τον παρακείμενο-1 διαχωρισμό των χρωμοσωμάτων στην πρώτη μειωτική διαίρεση MI. Από το συγκεκριμένο περιστατικό φάνηκε ότι η ανάλυση της μετάθεσης είναι εφικτή μόνο μέσω της ανάλυσης και των δυο πολικών σωματίων. Στη παρούσα μελέτη φάνηκε ότι:Α) Η χρωμοσωμική ανάλυση του ενός κυττάρου με την τεχνική του FISH στο στάδιο της αυλάκωσης σε ένα κύτταρο μπορεί να διακρίνει το παθολογικό, αλλά όχι τον ακριβή γονότυπο. Β) Από τη σύγκριση των δυο μεθοδολογιών χρωμοσωμικής ανάλυσης, το περιθώριο λάθους λόγω τεχνικού σφάλματος ήταν σημαντικά μεγαλύτερο στην περίπτωση της εφαρμογής του FISH σε σχέση με το arrayCGH.Γ) Η συχνότητα των φυσιολογικών εμβρύων στους φορείς ισοζυγισμένων μεταθέσεων δεν ήταν σημαντικά διαφορετική ανάμεσα στα δυο φύλα, αν και τα ποσοστά κλινικών κυήσεων ήταν πολύ υψηλότερα στην περίπτωση που οι φορείς ήταν γυναίκες. Ο εναλλασσόμενος είχε μικρότερη συχνότητα στις γυναίκες ως τύπος διαχωρισμού. Η συχνότητα φυσιολογικών γαμετών ήταν μικρότερη όταν στις αμοιβαίες μεταθέσεις συμμετείχαν ακροκεντρικά χρωμοσώματα, γεγονός που μπορεί να οφείλεται στο ότι τα ακροκεντικά είναι λιγότερο σταθερά από τα μετα- και τα υπομετακεντρικά χρωμοσώματα στη διάρκεια του διαχωρισμού τους στη μείωση. Δεν παρατηρήθηκε μείωση στη συχνότητα των ισοζυγισμένων εμβρύων στην περίπτωση που τα σημεία θραύσης των μεταθέσεων ήταν κοντά στα τελομερίδια. Δ) Η ανάλυση των χρωμοσωμικών ανωμαλιών στο ωάριο είναι αξιόπιστη όταν αναλύονται και τα δυο πολικά σωμάτια. Από την επανεξέταση των εμβρύων στο στάδιο της αυλάκωσης φάνηκε ότι τα έμβρυα αληθώς κρίθηκαν ως ανευπλοειδικά βάσει της χρωμοσωμικής ανάλυσης των πολικών σωματίων. Οι ανευπλοειδίες μητρικής προέλευσης, που ανιχνεύθηκαν στα πολικά σωμάτια, αποτέλεσαν το 93% των ανευπλοειδιών στα έμβρυα στο στάδιο της αυλάκωσης. Το 98.5% των ανευπλοειδιών μητρικής προέλευσης για συγκεκριμένα χρωμοσώματα που ανιχνεύθηκαν στα πολικά σωμάτια επιβεβαιώθηκαν στα 30 επανεξεταζόμενα έμβρυα. Ωστόσο, 17 (17%) αριθμητικές αλλαγές χρωμοσωμάτων στα πολικά σωμάτια δεν επιβεβαιώθηκαν στα αντίστοιχα έμβρυα, γεγονός που θα πρέπει να αναφέρεται στη συμβουλευτική των γυναικών που υπεισέρχονται σε κύκλο εξωσωματικής γονιμοποίησης σε συνδυασμό με την ανάλυση των πολικών σωματίων των ωαρίων τους. Το ψευδώς θετικό αποτέλεσμα σε ένα ή και στα δυο πολικά σωμάτια αποδόθηκε κυρίως σε σημαντικά μικρότερο ποσοστό λογαριθμικών μετατοπίσεων σε σχέση με αυτό που αναμένεται για ολόκληρα χρωμοσώματα ή χρωματίδες σε γραφήματα μικροσυστοιχιών DNA. Γι’αυτό αν και η τεχνολογία των μικροσυστοιχιών DNA έχει βελτιωθεί τελευταία τα τεχνικά λάθη εξακολουθούν να προκύπτουν από τον πολλαπλασιασμό όλου του γονιδιώματος. Το γεγονός αυτό καταδεικνύει την αναγκαιότητα της βελτίωσης της τεχνικής για την αρτιότερη εφαρμογή της σε κλινικό επίπεδο.Ε) Ο πρώιμος διαχωρισμός των αδελφών χρωματίδων ήταν ο κυρίαρχος μηχανισμός που οδήγησε σε ανευπλοειδίες στη διάρκεια των δυο μειωτικών διαιρέσεων και επικρατεί στα ωάρια γυναικών προχωρημένης ηλικίας. Το φαινόμενο αυτό μπορεί να είναι αποτέλεσμα της παρατεταμένης έκθεσης των χρωμοσωμάτων στο στάδιο της δικτυοταινίας στην πρώτη μειωτική διαίρεση.Η) Η χρωμοσωμική ανάλυση των πολικών σωματίων με την τεχνική arrayCGH συμβάλει στην αναγνώριση των ωαρίων που δίνουν είτε μη βιώσιμα έμβρυα λόγω σύνθετων χρωμοσωμικών ανωμαλιών είτε έμβρυα με ανευπλοειδίες που μπορεί να οδηγήσουν σε αποβολή, γεγονός σημαντικό για την συμβουλευτική των γυναικών όσον αφορά τη πιθανότητα βιώσιμης κύησης σε επόμενους κύκλους εξωσωματικής γονιμοποίησης (ΙVF) χρησιμοποιώντας τα δικά τους ωάρια. Συνεπώς, η βιοψία στο στάδιο των ωαρίων με τη λήψη των πολικών σωματίων, αντί του σταδίου της αυλάκωσης, σε συνδυασμό με την ανάλυση του συνόλου των χρωμοσωμάτων μπορεί να αποτελέσουν στο μέλλον τον εναλλακτικό τρόπο της ανίχνευσης ανευπλοειδιών στα έμβρυα. Για τον σκοπό αυτό απαιτείται βέβαια και η προοπτική μελέτη μεγάλου αριθμού κύκλων με ή χωρίς προεμφυτευτικό έλεγχο με την μεθοδολογία που αναπτύχθηκε στην παρούσα εργασία, έτσι ώστε να καταδειχθεί η συνεισφορά της στα ποσοστά κυήσεων.