Ανοσιακή απάντηση ασθενών με αιμορραγικό πυρετό με νεφρική προσβολή και ασθενών με αιμορραγικό πυρετό Κριμαίας-Κονγκό

Abstract

Two viral hemorrhagic fevers have been reported in Greece, hemorrhagic fever with renal syndrome (HFRS) caused by hantaviruses (in Greece mainly by Dobrava-Belgrade virus, DOBV) and Crimean-Congo hemorrhagic fever (CCHF) caused by CCHF virus (CCHFV). Even though the pathogenesis of these diseases is not fully understood, the activation of immune response system and the secretion of cytokines, known as “cytokine storm”, is thought to play a major role. Aim of the present thesis was to investigate the immune response in patients with HFRS and in patients with CCHF, focused on the evaluation of the cytokine patterns in relation with the clinical course and/or the outcome of the disease.Materials and methods: The study included 54 blood samples collected 5-70 days (mean 13.5 days) after onset of the disease from 30 HFRS patients (26 males) aged 17-70 years (median age 35.5 years), and 29 blood samples collected 1-9 days (mean 4.9 days) after onset of the disease from 29 CCHF patients (12 males) aged 4-67 years (median age 44 years). One HFRS case was fatal and 17 were considered as severe, while two CCHF cases were fatal and 8 were considered as severe. The samples were divided into groups according to the clinical course, the outcome of the disease and the days collected post symptoms' onset (day of illness). Serum samples from 16 apparently healthy individuals (9 males) aged 18-65 years (median age 45 years) were included in the study as control group. IgM and IgG antibodies against hantaviruses and CCHFV were detected using indirect immunofluorescent assay (IFA) and ELISA, while viral RNA was detected using RT-nested PCR and real time RT-PCR. The serum levels of 27 cytokines [interleukin (IL)-1b, IL-1ra, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, eotaxin, FGF-b, G-CSF, GM-CSF, IFN-γ, IP-10, MCP-1, MIP-1a, MIP-1b, PDGF-bb, RANTES, TNF-α and VEGF] were estimated using the BioPlexTM Suspension Array System (Bio-Rad Laboratories, CA).Results: IgM and IgG antibodies against hantaviruses were detected in all HFRS patients; hantavirus RNA was detected by RT-nested PCR in 22/29 (75.9%) samples which had been taken up to 16th day of illness. Sequencing of the PCR products showed that in all cases the causative agent was DOBV. During the first two weeks of illness, and compared to the control group, significantly elevated IL-1ra, IL-6, IL-8, IL-9, IL-10, GM-CSF, ΙΡ-10, ΜΙΡ-1b, PDGF, TNF-α and VEGF levels were observed in the severe cases, while in the non-severe cases, IL-13 and TNF-α levels were significantly elevated (p<0.05). In the two samples from the fatal case it was seen that the levels of IL-1b, IL-4, IL-7 IL-13, IL-17, MIP-1a and PDGF were decreased, while the levels of IL-6, IL-8, IL-10, IP-10 and MIP-1b were increased (p<0.05). A strong immune response was seen during the first week of illness, especially in severe cases, while the response in non-severe cases was weaker and delayed. During the 3rd week of illness or later and compared to the control group, serum levels of IL-9, IL-10, ΜΙΡ-1b, PDGF and VEGF remained elevated in severe cases, while levels of IL-6, IL-8, IL-10, IP-10 and MIP-1a remained elevated in the two samples from the fatal case (up to the death). In contrast in non-severe cases, the serum levels of most cytokines were similar to those of the control group. In all groups, IP-10 was increased and RANTES was decreased (p<0.05). Univariate logistic regression analysis showed that high serum levels of IL-8, IL-10 and VEGF were associated with disease severity, while multivariate regression analysis revealed VEGF as the most independent factor.Among the 29 CCHF patients, IgM antibodies were detected in 14 (48.3%), while IgG antibodies were not detected. Real-time RT-PCR was positive in all samples, while RT-nested PCR was positive in 23/29 (79.3%) samples. Compared to the control group, significantly elevated IL-6, IL-8, IL-9, IL-10, IL-13, GM-CSF, IFN-γ και IP-10 levels were found in severe cases (p<0,05), while in non-severe cases, increased levels were seen in IL-1ra, IL-6, IL-8, IL-10, IP-10, MCP-1 and VEGF (p<0,05). Levels of IL-1b, IL-6, IL-8, IL-9, IL-10, IL-15, eotaxin, ΙΡ-10, MCP-1 and TNF-α were increased in the fatal cases (p<0.05). In all groups, IL-6, IL-8, IL-10 and IP-10 were increased, with the highest levels being observed in the fatal cases (p<0.05). Among survivors, IP-10 and MCP-1 were higher in severe than in non-severe cases (p<0.05). Significantly higher levels of IL-1b, IL-6, IL-8, IL-9, IL-10, IL-15, ΙΡ-10, MCP-1 and TNF-α were observed in fatal than in non-fatal cases (p<0.05). The viral load was positively correlated with IL-10, IP-10, and MCP-1 levels, and negatively correlated with the ratio IL- 12/IL-10 (p<0.05). Multivariate logistic regression analysis showed that viral load and IP-10 were associated with disease severity and fatal outcome, while multivariate analysis revealed IP-10 as the most independent factor.Comparing the cytokine levels between HFRS and CCHF, several similarities and differences were noticed. No significant differences were found among fatal cases, while among survivors, mean levels of IL-8, IL-9, IL-10 and eotaxin were higher in HFRS patients (p<0.05). Compared to the control group, mean level of RANTES was decreased in both HFRS and CCHF patients (p<0.05). Similarly, in fatal HFRS and CCHF cases IP-10 was increased and IL-4 was decreased (p<0.05). Levels of IL-10 were increased only in fatal HFRS cases (p<0.05), while in fatal CCHF cases, MCP-1 and TNF-α were significantly increased and IL-12 was decreased (p<0.05). Mean levels of IL-6 and IL-8 were increased in HFRS cases and in fatal CCHF cases (p<0.05). VEGF was increased only in HFRS survivors (p<0.05). Conclusions: The present study showed that the immune response in HFRS and CCHF patients is time dependent and affects and is affected by the course and the outcome of the disease. Immune response in severe cases is stronger than in non-severe cases. VEGF and IP-10 can serve as possible biomarkers of disease severity in HFRS and in CCHF, respectively. The similarities of the immune response in HFRS and in CCHF suggest common pathophysiology of viral hemorrhagic fevers, while the observed differences are likely due to variations of interactions between viruses and the target host cells. The results of the study could be the basis of future research aiming to treatment and vaccine design.

Οι ιογενείς αιμορραγικοί πυρετοί που ενδημούν στην Ελλάδα είναι ο αιμορραγικός πυρετός με νεφρική προσβολή (hemorrhagic fever with renal syndrome, HFRS) που οφείλεται σε χανταϊούς, και κυρίως στον ιό Dobrava-Belgrade (Dobrava-Belgrade virus, DOBV) και ο αιμορραγικός πυρετός Κριμαίας-Κονγκό (Crimean-Congo hemorrhagic fever, CCHF) που οφείλεται στον ομώνυμο ιό (CCHF virus, CCHFV). Οι παθογενετικοί μηχανισμοί των αιμορραγικών πυρετών δεν είναι επαρκώς γνωστοί, ωστόσο η ενεργοποίηση της ανοσιακής απάντησης και η υπερέκκριση κυτταροκινών, γνωστή ως "καταιγίδα κυτταροκινών" φαίνεται να παίζουν σημαντικό ρόλο. Σκοπός της παρούσας διατριβής ήταν η μελέτη της ανοσιακής απάντησης σε ασθενείς με HFRS και σε ασθενείς με CCHF, κυρίως όσον αφορά την εκτίμηση και την αξιολόγηση των επιπέδων των κυτταροκινών και την συσχέτιση αυτών με το στάδιο, την έκβαση και τη βαρύτητα της νόσου. Υλικό και μέθοδοι: Στη μελέτη περιλήφθηκαν 54 δείγματα αίματος που ελήφθησαν 5-70 μέρες (μέση ημέρα νόσου 13,5) μετά την έναρξη των συμπτωμάτων από 30 ασθενείς με HFRS (26 άνδρες) ηλικίας 17-70 ετών (διάμεση ηλικία 35,5 έτη), καθώς και 29 δείγματα αίματος που ελήφθησαν 1-9 ημέρες μετά την έναρξη των συμπτωμάτων (μέση ημέρα νόσου 4,9) από 29 ασθενείς με CCHF (12 άνδρες) ηλικίας 4-67 ετών (διάμεση ηλικία 44 έτη). Ένα περιστατικό HFRS ήταν θανατηφόρο, και άλλα 17 περιστατικά θεωρήθηκαν σοβαρά. Δύο περιστατικά CCHF ήταν θανατηφόρα, και άλλα 8 θεωρήθηκαν σοβαρά περιστατικά. Tα δείγματα των ασθενών διαχωρίστηκαν σε ομάδες με βάση την έκβαση, τη βαρύτητα και τον αριθμό των ημερών που μεσολάβησαν από την έναρξη των συμπτωμάτων μέχρι τη λήψη του δείγματος. Την ομάδα ελέγχου αποτέλεσαν 16 δείγματα από 16 υγιή άτομα (9 άνδρες) ηλικίας 18-65 ετών (διάμεση ηλικία 45 έτη).Τα δείγματα των ασθενών εξετάστηκαν για την ύπαρξη IgM και IgG αντισωμάτων έναντι των χανταϊών και του CCHFV με μεθόδους ELISA και έμμεσου ανοσοφθορισμού, ενώ η ανίχνευση του ιικού RNA έγινε με RT-nested PCR και real time RT-PCR. Τα επίπεδα 27 κυτταροκινών [ιντερλευκίνη (IL)-1b, IL-1ra, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-13, IL-15, IL-17, εοταξίνη, FGFb, G-CSF, GM-CSF, IFN-γ, IP-10, MCP-1, MIP-1a, MIP-1b, PDGF-bb, RANTES, TNF-α και VEGF] μετρήθηκαν ταυτόχρονα με τη χρήση της τεχνολογίας BioPlexTM Suspension Array System (Bio-Rad Laboratories, CA).Αποτελέσματα: Σε όλους τους ασθενείς με HFRS ανιχνεύτηκαν IgM και IgG αντισώματα έναντι των χανταϊών. Με RT-nested PCR ανιχνεύθηκε RNA χανταϊού, και συγκεκριμένα του DOBV, σε 22/29 (75,9%) δείγματα ασθενών που είχαν ληφθεί μέχρι την 16η ημέρα της νόσου. Κατά τις πρώτες δύο εβδομάδες της νόσου, και συγκριτικά με την ομάδα ελέγχου, τα σοβαρά περιστατικά παρουσίασαν αυξημένα επίπεδα των παρακάτω κυτταροκινών: IL-1ra, IL-6, IL-8, IL-9, IL-10, GM-CSF, ΙΡ-10, ΜΙΡ-1b, PDGF, TNF-α και VEGF (p<0,05). Τα ήπια περιστατικά παρουσίασαν αυξημένα επίπεδα των IL-13 και TNF-α (p<0,05). Στα δύο δείγματα από το θανατηφόρο περιστατικό HFRS παρατηρήθηκαν χαμηλά επίπεδα των IL-1b, IL-4, IL-7 IL-13, IL-17, MIP-1a και PDGF, ενώ τα επίπεδα των IL-6, IL-8, IL-10, IP-10 και MIP-1b ήταν υψηλά (p<0,05). Ισχυρή ανοσιακή απάντηση παρατηρήθηκε κατά την 1η εβδομάδα της νόσου, ιδιαίτερα στα σοβαρά περιστατικά, ενώ στα ήπια ήταν ηπιότερη και εμφανιζόταν αργότερα. Μετά το πέρας της 2ης εβδομάδας νόσου, και συγκριτικά με την ομάδα ελέγχου, τα σοβαρά περιστατικά διατήρησαν υψηλά τα επίπεδα των IL-9, IL-10, ΜΙΡ-1b, PDGF και VEGF, ενώ στα δύο δείγματα από το θανατηφόρο περιστατικό διατηρήθηκαν αυξημένα τα επίπεδα των IL-6, IL-8, IL-10, IP-10 και MIP-1a (p<0,05). Αντίθετα, η πλειοψηφία των κυτταροκινών στα ήπια περιστατικά ήταν σε επίπεδα παρόμοια με αυτά της ομάδας ελέγχου. Σε όλες τις ομάδες ασθενών τα επίπεδα της IP-10 ήταν αυξημένα και της RANTES μειωμένα (p<0,05). Η μονοπαραγοντική ανάλυση έδειξε ότι τα υψηλά επίπεδα των IL-8, IL-10 και VEGF παρουσίασαν σημαντική συσχέτιση με την εμφάνιση σοβαρής νόσου, ενώ η πολυπαραγοντική ανάλυση ανέδειξε τον VEGF ως τον πλέον ισχυρό παράγοντα. Μεταξύ των 29 ασθενών με CCHF, IgM αντισώματα έναντι του ιού ανιχνεύθηκαν σε 14 (48,3%). Σε κανέναν δεν ανιχνεύθηκαν αντισώματα IgG. Η Real-time RT-PCR ήταν θετική σε όλα τα δείγματα, ενώ η RT-nested PCR ήταν θετική σε 23/29 (79,3%) δείγματα. Συγκριτικά με την ομάδα ελέγχου τα σοβαρά περιστατικά παρουσίασαν αυξημένα επίπεδα των παρακάτω κυτταροκινών: IL-6, IL-8, IL-9, IL-10, IL-13, GM-CSF, IFN-γ και IP-10 (p<0,05). Τα ήπια περιστατικά παρουσίασαν αυξημένα επίπεδα των IL-1ra, IL-6, IL-8, IL-10, IP-10, MCP-1 και VEGF (p<0,05). Στα θανατηφόρα περιστατικά τα επίπεδα των IL-1b, IL-6, IL-8, IL-9, IL-10, IL-15, εοταξίνης, ΙΡ-10, MCP-1 και TNF-α ήταν αυξημένα (p<0,05). Τα επίπεδα των IL-6, IL-8, IL-10 και IP-10 ήταν αυξημένα και στις τρεις ομάδες σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου, με υψηλότερα επίπεδα στα θανατηφόρα περιστατικά (p<0,05). Μεταξύ των επιζώντων, τα επίπεδα των IP-10 και MCP-1 ήταν υψηλότερα στα σοβαρά περιστατικά συγκριτικά με τα ήπια. Τα επίπεδα των IL-1b, IL-6, IL-8, IL-9, IL-10, IL-15, ΙΡ-10, MCP-1 και TNF-α ήταν υψηλότερα στα θανατηφόρα περιστατικά συγκριτικά με τα μη θανατηφόρα (p<0,05). Το ιικό φορτίο παρουσίασε θετική συσχέτιση με τα επίπεδα των IL-10, ΙΡ-10 και MCP-1 και αρνητική συσχέτιση με τον λόγο IL-12/IL-10. Η μονοπαραγοντική ανάλυση έδειξε ότι το ιικό φορτίο και η ΙΡ-10 παρουσίασαν σημαντική συσχέτιση με την εμφάνιση σοβαρής νόσου, ενώ η πολυπαραγοντική ανάλυση ανέδειξε την ΙΡ-10 ως τον πλέον ισχυρό παράγοντα.Συγκρίνοντας τα επίπεδα των κυτταροκινών στους δύο ιογενείς αιμορραγικούς πυρετούς, στα μεν θανατηφόρα περιστατικά δεν παρατηρήθηκε σημαντική διαφορά, μεταξύ όμως των επιζώντων, οι μέσες τιμές των IL-8, IL-9, IL-10 και εοταξίνης ήταν σημαντικά υψηλότερες στους ασθενείς με HFRS (p<0,05). Συγκριτικά με την ομάδα ελέγχου, η RANTES ήταν ελαττωμένη σε όλους τους ασθενείς (p<0,05). Στα θανατηφόρα περιστατικά HFRS και CCHF η IP-10 ήταν αυξημένη και η IL-4 ελαττωμένη (p<0,05). Τα επίπεδα της IL-10 ήταν αυξημένα μόνο στα θανατηφόρα περιστατικά HFRS, ενώ μόνο στα θανατηφόρα περιστατικά CCHF, τα επίπεδα των MCP-1 και TNF-α ήταν αυξημένα (p<0,05). Η IL-6 και η IL-8 ήταν αυξημένη σε όλους τους ασθενείς με HFRS και στα θανατηφόρα περιστατικά CCHF (p<0,05). Ο VEGF ήταν αυξημένος μόνο στους επιζήσαντες του HFRS. Συμπεράσματα: Η παρούσα μελέτη έδειξε ότι η ανοσιακή απάντηση των ασθενών με HFRS και CCHF εξαρτάται σημαντικά από την χρονική φάση της νόσου, και επηρεάζεται, αλλά και επηρεάζει την κλινική πορεία και την έκβαση της νόσου. Η ανοσολογική απάντηση είναι εντονότερη στα σοβαρά περιστατικά HFRS και CCHF σε σύγκριση με τα ήπια περιστατικά. Γενικά, ο VEGF και η IP-10 είναι δυνατόν να θεωρηθούν ως προγνωστικοί δείκτες βαρύτητας της νόσου στον HFRS και τον CCHF, αντίστοιχα. Οι ομοιότητες της ανοσιακής απάντησης στον HFRS και τον CCHF είναι αποτέλεσμα της κοινής παθοφυσιολογίας των ιογενών αιμορραγικών πυρετών, ενώ οι διαφορές πιθανώς οφείλονται σε παραλλαγές των αλληλεπιδράσεων μεταξύ των ιών και των κυττάρων-στόχων του ξενιστή. Τα αποτελέσματα της μελέτης μπορούν να αποτελέσουν βάση για μελλοντικές έρευνες με στόχο τον σχεδιασμό θεραπευτικών σχημάτων και εμβολίων.