Cortisol dynamics in European sea bass, Dicentrarchus labrax L: factors inducing variability and its molecular and endocrine regulation

Abstract

The aim of the present study was to get a better insight into environmental, husbandry, and genetic factors that affect cortisol regulation and variability, as well as control the cortisol stress response in a Mediterranean marine teleost, the European sea bass, Dicentrarchus labrax.In order to examine how the environment can modify cortisol regulation, the effects of water temperature on cortisol dynamics so before stress as after exposure to acute stress were studied. Three water temperatures were examined, i.e. 15, 20, and 25°C, which reflect the range of temperature fluctuation in Mediterranean aquaculture. Fish were acclimated at the respective temperature for 2 weeks before sampling. Blood and water samples were collected prior and at 0.5, 1, 2, 4, and 8 hours post-stress for cortisol analysis. Results showed that water temperature affected the resting and post-stress levels of cortisol. Specifically, higher resting concentrations were observed at 20°C and 25°C than at 15°C. In terms of response, cortisol in all temperatures examined responded with higher post-stress levels. However, the rapidity of the response was greater at the higher temperatures, in both terms of time to peak and to recover, while at the lowest temperature the response was delayed and prolonged. Additionally, the overall outcome of the response, as indicated by the AUC, was greater at 15°C. The release of cortisol in the water was also affected by temperature, being slower and of lower intensity at the low temperature examined. In conclusion, differences in the pattern of response between temperatures for E. sea bass could have resulted from temperature-derived differences in cortisol synthesis and/or clearance rates, but also due to differences in the rate of cortisol release in the water.A repeated predictable stress protocol of various intensities was developed to investigate how husbandry stress of increasing intensity can exert different allostatic loads on fish and how this could affect cortisol dynamics and peripheral regulation in tissues like liver and head kidney. Fish were left undisturbed (controls) or exposed to three levels of repeated predictable stress for three weeks and then subjected to an additional acute stress test. The stress protocol used a combination of common husbandry practices, such as chasing with a net, confinement and air-exposure, and was categorized as low, medium and high according to its intensity. Specifically, low stress consisted of subjecting fish to confinement at 50 % of the tank for 30 min every 2nd day; medium stress consisted of both confinement (conducted as previously described) and chasing for 5 min with a net every 2nd day; high stress consisted of confining fish at 25% of the tank for 30 min, and chasing for 5 min every 2nd day, coupled with a 1-min air-exposure stressor once per week. Two days after the end of the application of this protocol, 10 fish per tank were immediately sampled (T0), while the remaining 10 fish were acutely stressed by chasing them for 5 min and exposing them to air for 1 min, and sampled 1 hour later. Results showed that body weight gain was significantly reduced as stress load increased, leading eventually to body weight loss in the high stress group. Feeding was also reduced in all stress groups compared to controls. In terms of cortisol, fish exposed to high stress exhibited high basal cortisol levels and an inability to further respond to acute stress. At the molecular level, upregulation of the expression of adrenocorticotropic hormone (ACTH) receptor, mc2r, and of cortisol biosynthesis enzyme 11β-hydroxylase was observed in the head kidney of all stress load groups compared to controls. Additionally, in the high load group the dysregulation of the balance between the expression of glucocorticoid, gr, and mineralocorticoid, mr. receptors, as well as the lower hepatic gene expression of 11β-hsd2, an enzyme that inactivates cortisol, possible indicate the basis behind the high cortisol levels seen in this group.Genetic background along with the environment is well known to affect the phenotype of individuals. For that reason, it was aimed to assess how the genetic background can influence the variability of cortisol response at both family and individual level and subsequently explore the hepatic transcriptome profile of fish showing consistently low (LR) or high (HR) cortisol responsiveness. The progeny (full sibs) of six families was used, and sampled for plasma cortisol after an acute stress challenge once per month, for four consecutive months. Results suggested that cortisol response was affected by the genetic background, as seen by the family-based differences, and that individual responsiveness was a repeatable trait. Subsequently, LR and HR fish were identified, and showed low or high resting, free and post-stress cortisol concentrations, respectively. These differences could not be explained by differences in the plasma ACTH concentrations. Finally, the liver transcription profiles of LR and HR fish showed some important differences, indicating differential hepatic regulation between these divergent phenotypes. These transcription differences were related to various metabolic and immunological processes, with 169 transcripts being transcribed exclusively in LR and 161 in HR fish.Mechanisms regulating different cortisol responsiveness between LR and HR individuals have been poorly studied. In this context, it was aimed to study these mechanisms at the level of the head kidney in LR and HR fish of E. sea bass. To do so, initially resting plasma cortisol and ACTH concentrations were estimated in LR and HR approximately 1.5 years after their characterization as such. The head kidneys of these individuals were superfused through an in vitro superfusion system, and stimulated with the same dose of ACTH to assess their cortisol biosynthetic capacity. Moreover, the expression of important for cortisol regulation genes was estimated in the head kidneys. Results showed that LR and HR fish differed in the resting cortisol levels, although no differences existed in the circulating levels of ACTH. Additionally, the biosynthetic capacity of HR was higher than that of LR fish when in vitro stimulated with the same concentration of ACTH. At the molecular level, differences in resting cortisol between LR and HR fish could be attributed to a higher expression of the ACTH receptor, mc2r, and the 2.3-fold higher expression of 11β-hydroxylase, an enzyme involved in cortisol biosynthesis in the HR fish. Finally, a significant downregulation of 11β-hsd2, an enzyme involved in cortisol inactivation was observed in HR when compared to LR fish, indicating for the first time that post-production regulation of cortisol in the head kidney can also explain the differences observed between these divergent phenotypes.

Σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η μελέτη περιβαλλοντικών, διαχειριστικών και γενετικών παραγόντων που μπορούν να επηρεάσουν τη ρύθμιση και τη μεταβλητότητα της κορτιζόλης, καθώς επίσης και την απόκριση αυτής στην καταπόνηση σε ένα είδος της Μεσογειακής ιχθυοκαλλιέργειας, το λαβράκι, Dicentrarchus labrax.Για το σκοπό αυτό, αρχικά μελετήθηκε η επίδραση της περιβαλλοντικής θερμοκρασίας νερού στα επίπεδα κορτιζόλης, τόσο πριν όσο και μετά την έκθεση σε οξεία καταπόνηση. Ελέγχθηκαν τρεις περιβαλλοντικές θερμοκρασίες, συγκεκριμένα 15, 20, και 25°C, οι οποίες αντικατοπτρίζουν το εύρος θερμοκρασιών που συνήθως συναντάται στην Μεσογειακή ιχθυοκαλλιέργεια. Τα ψάρια εγκλιματίστηκαν σε αυτές τις θερμοκρασίες για δύο εβδομάδες πριν τη δειγματοληψία. Συλλέχθηκαν δείγματα αίματος και νερού για τον προσδιορισμό της κορτιζόλης τόσο πριν όσο και 0.5, 1, 2, 4 και 8 ώρες μετά την έκθεση σε οξεία καταπόνηση. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η θερμοκρασία του νερού επιδρά στις συγκεντρώσεις κορτιζόλης, τόσο σε συνθήκες ηρεμίας όσο και μετά την έκθεση σε οξεία καταπόνηση. Συγκεκριμένα, υψηλότερες συγκεντρώσεις κορτιζόλης σε συνθήκες ηρεμίας παρατηρήθηκαν στους 20°C και 25°C συγκριτικά με τους 15°C. Όσον αφορά στην απόκριση στην καταπόνηση, παρατηρήθηκε απόκριση με αύξηση των συγκεντρώσεων κορτιζόλης σε όλες τις θερμοκρασίες που ελέγχθηκαν. Παρ’ όλα αυτά, η ταχύτητα της απόκρισης, εκφρασμένη ως ο χρόνος που χρειάζεται για να επιτευχθούν τόσο οι μέγιστες συγκεντρώσεις όσο και η επαναφορά σε φυσιολογικά επίπεδα, ήταν μεγαλύτερη στις υψηλότερες θερμοκρασίες, ενώ αντίθετα η απόκριση στη χαμηλότερη θερμοκρασία ήταν πιο αργή και παρατεταμένη. Επιπλέον, η συνολική απόκριση, όπως αποτυπώθηκε από την Περιοχή Κάτω από την Καμπύλη (AUC), ήταν μεγαλύτερη στους 15°C. Ο ρυθμός απελευθέρωσης κορτιζόλης στο νερό επίσης επηρεάστηκε από τη θερμοκρασία και συγκεκριμένα ήταν πιο αργός και χαμηλότερης έντασης στη χαμηλή θερμοκρασία. Συμπερασματικά, οι διαφορές που παρατηρήθηκαν στο πρότυπο της απόκρισης μεταξύ των διαφορετικών θερμοκρασιών που ελέγχθηκαν θα μπορούσαν να έχουν προκύψει από διαφορές στους ρυθμούς σύνθεσης ή καταβολισμού της κορτιζόλης, αλλά και από διαφορές στους ρυθμούς απελευθέρωσης της κορτιζόλης στο νερό.Για τη διερεύνηση του κατά πόσο και με ποιο τρόπο οι διαχειριστικές πρακτικές που προξενούν καταπόνηση μπορούν να προκαλέσουν διαφορετικά αλλοστατικά φορτία στα ψάρια και πως αυτό εν συνεχεία μπορεί να επηρεάσει τη ρύθμιση της κορτιζόλης, αναπτύχθηκε και εφαρμόστηκε ένα πρωτόκολλο επαναλαμβανόμενης προβλέψιμης καταπόνησης διαφορετικής έντασης. Συγκεκριμένα, χωρίστηκαν τέσσερεις ομάδες ψαριών, μία εκ των οποίων δεν υπέστη κανένα χειρισμό (ομάδα ελέγχου), ενώ οι άλλες τρεις εκτέθηκαν σε επαναλαμβανόμενη προβλέψιμη καταπόνηση διαφορετικής έντασης για τρεις εβδομάδες. Το πρωτόκολλο καταπόνησης που αναπτύχθηκε προσομοίαζε συχνές διαχειριστικές πρακτικές όπως κυνηγητό με την απόχη, περιορισμός του διαθέσιμου χώρου και έκθεση στον αέρα και κατηγοριοποιήθηκε ως χαμηλής, μέτριας και υψηλής έντασης. Συγκεκριμένα, η χαμηλής έντασης καταπόνηση περιελάμβανε τη μείωση του διαθέσιμου χώρου της δεξαμενής στο 50 % για 30 λεπτά κάθε δεύτερη μέρα, ενώ η μέτριας έντασης στον περιορισμό των ψαριών με τον ίδιο τρόπο, συνοδευόμενη επιπλέον από 5 λεπτά κυνηγητού με την απόχη. Τέλος, η υψηλής έντασης καταπόνηση αφορούσε στον περιορισμό των ψαριών στο 25 % της δεξαμενής για 30 λεπτά και κυνηγητό με την απόχη για 5 λεπτά κάθε δύο μέρες, ενώ επιπλέον γινόταν και έκθεση των ψαριών στον αέρα για 1 λεπτό, κάθε 7 μέρες. Μετά το πέρας της εφαρμογής του πρωτοκόλλου για το αλλοστατικό φορτίο συλλέχθηκε αίμα από 10 ψάρια από κάθε δεξαμενή χωρίς να τους γίνει οποιοσδήποτε άλλος χειρισμός (Τ0), ενώ στο υπόλοιπα 10 ψάρια έλαβε χώρα ένα επιπλέον συμβάν οξείας καταπόνησης, κυνηγώντας τα για 5 λεπτά με την απόχη και εκθέτοντάς τα στον αέρα για 1 λεπτό (Τ1). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι το σωματικό βάρος μετά την έκθεση στο πρωτόκολλο καταπόνησης ήταν αντιστρόφως ανάλογο της ένταση του πρωτοκόλλου, οδηγώντας ακόμα και σε μείωση βάρους, σε σχέση με το αρχικό, στα ψάρια που εκτέθηκαν στην υψηλή καταπόνηση. Επιπλέον, τα ψάρια που εκτέθηκαν στο πρωτόκολλο υψηλής έντασης εμφάνισαν υψηλά επίπεδα κορτιζόλης στο πλάσμα και αδυναμία περαιτέρω απόκρισης μετά την έκθεση σε ένα επιπλέον συμβάν οξείας καταπόνησης. Σε μοριακό επίπεδο, παρατηρήθηκαν αυξημένα επίπεδα γονιδιακής έκφρασης του υποδοχέα της αδρενοκορτικοτρόπου ορμόνης ACTH, mc2r, και του ενζύμου 11β-υδροξυλάση, που συμμετέχει στη βιοσύνθεση της κορτιζόλης, στο πρόσθιο τμήμα του νεφρού ψαριών που εκτέθηκαν σε καταπόνηση σε σχέση με την ομάδα ελέγχου. Επιπλέον, στην ομάδα υψηλής καταπόνησης παρατηρήθηκε απορρύθμιση της ισορροπίας μεταξύ της έκφρασης των γλυκοκορτικοειδών (gr) και του αλατοκορτικοειδούς υποδοχέων στον υποθάλαμο του εγκεφάλου, καθώς επίσης και μειωμένη ηπατική έκφραση του ενζύμου 11β-υδροξυστεροειδής δεϋδρογονάση τύπου 2 (11β-hsd2), που δρα αδρανοποιώντας την κορτιζόλη, υποδεικνύοντας έτσι πιθανούς λόγους που οδήγησαν στα αυξημένα επίπεδα κορτιζόλης στα ψαριών αυτά. Είναι ευρέως γνωστό ότι το γενετικό υπόβαθρο μαζί με το περιβάλλον διαμορφώνουν το φαινότυπο ενός ατόμου. Για το σκοπό αυτό επιχειρήθηκε να εκτιμηθεί κατά πόσο το γενετικό υπόβαθρο μπορεί να επηρεάσει την παρατηρούμενη μεταβλητότητα στα επίπεδα κορτιζόλης του λαβρακιού, τόσο σε επίπεδο οικογενειών όσο και ατόμων. Επιπλέον, πραγματοποιήθηκε διερεύνηση του ηπατικού μεταγραφικού προτύπου σε άτομα που δείχνουν σταθερά χαμηλή (LR) ή υψηλή (HR) απόκριση κορτιζόλης. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκαν οι απόγονοι 6 οικογενειών λαβρακιού, οι οποίοι εκτίθονταν σε οξεία καταπόνηση μία φορά το μήνα και για τέσσερεις συνεχόμενους μήνες με σκοπό να εκτιμηθούν τα επίπεδα κορτιζόλης στο αίμα τους μετά την καταπόνηση. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η απόκριση της κορτιζόλης επηρεάζεται σημαντικά από το γενετικό υπόβαθρο, όπως αποτυπώθηκε από τις διαφορές μεταξύ των οικογενειών, καθώς επίσης ότι η ατομική απόκριση είναι ένα χαρακτηριστικό με έντονη επαναληψιμότητα και σταθερότητα. Εν συνεχεία, άτομα χαμηλής (LR) και υψηλής (HR) απόκρισης αναγνωρίστηκαν, τα οποία διέφεραν, εκτός από τις συγκεντρώσεις μετά την καταπόνηση, τόσο στα επίπεδα ηρεμίας, δηλαδή απουσίας καταπόνησης, όσο και στα επίπεδα της ελεύθερης, μη δεσμευμένης σε πρωτεΐνες, κορτιζόλης. Οι διαφορές αυτές δεν μπορούσαν να αποδοθούν σε διαφορές στις συγκεντρώσεις της ACTH στο πλάσμα. Τέλος, παρατηρήθηκαν διαφορές στα πρότυπα της ηπατικής γονιδιακής έκφρασης μεταξύ των LR και HR ατόμων οι οποίες υποδεικνύουν διαφορετική ηπατική ρύθμιση μεταξύ των δύο αυτών φαινοτύπων. Οι μεταγραφικές διαφορές σχετίζονταν με διάφορες μεταβολικές και ανοσολογικές διεργασίες, με 169 μετάγραφα να εκφράζονται μόνο στο LR και 161 μόνο στα HR άτομα.Οι μηχανισμοί που ρυθμίζουν τη διαφορετική απόκριση της κορτιζόλης στην καταπόνηση μεταξύ LR και HR ατόμων δεν έχουν μελετηθεί επαρκώς. Στο πλαίσιο αυτό, επιχειρήθηκε να μελετηθεί ο μηχανισμός ρύθμισης των αποκλινόντων αποκρίσεων κορτιζόλης μεταξύ LR και HR ατόμων στο επίπεδο του πρόσθιου τμήματος του νεφρού. Για το λόγο αυτό, αρχικά εκτιμήθηκαν οι συγκεντρώσεις κορτιζόλης και ACTH σε συνθήκες ηρεμίας σε LR και HR άτομα, 1.5 χρόνο μετά τον χαρακτηρισμό τους ώστε να φανεί αν αυτό το χαρακτηριστικό διατηρείται στο χρόνο. Εν συνεχεία, δείγματα από το πρόσθιο τμήμα του νεφρού αυτών των ατόμων διεγέρθηκαν με ACTH σε ένα σύστημα in vitro επώασης και έγχυσης (superfusion) ώστε να ποσοτικοποιηθεί η βιοσυνθετική τους ικανότητα για παραγωγή κορτιζόλης. Επιπλέον, μελετήθηκε η έκφραση γονιδίων που συμμετέχουν στη ρύθμιση της σύνθεσης κορτιζόλης από το πρόσθιο τμήμα του νεφρού. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα LR και HR άτομα διέφεραν στις συγκεντρώσεις κορτιζόλης ηρεμίας ακόμα και 1.5 μετά τον χαρακτηρισμό τους, ενώ δεν υπήρχαν διαφορές στα επίπεδα της ACTH στο πλάσμα. Επιπλέον, η βιοσυνθετική ικανότητα των HR ήταν υψηλότερη από αυτή των LR ατόμων κατά την in vitro διέγερσή τους με την ίδια συγκέντρωση ACTH. Στο μοριακό επίπεδο, οι διαφορές στην κορτιζόλη ηρεμίας μεταξύ LR και HR ατόμων θα μπορούσαν να αποδοθούν στην υψηλότερη έκφραση του υποδοχέα της ACTH, mc2r, και την 2,3-φορές υψηλότερη, αν και όχι στατιστικά σημαντική, έκφραση της 11β-υδροξυλάσης που συμμετέχει στη βιοσύνθεση της κορτιζόλης στα HR άτομα. Τέλος, παρατηρήθηκε μία σημαντική υπό-έκφραση της 11β-υδροξυστεροειδούς δεΰδρογονάσης στα LR άτομα, υποδεικνύοντας έτσι για πρώτη φορά ότι τα επίπεδα της κορτιζόλης μπορεί να ρυθμίζονται στο πρόσθιο τμήμα του νεφρού ακόμα και αμέσως μετά την παραγωγή της ορμόνης εξηγώντας έτσι μέρος της διαφοράς στα επίπεδα της ορμόνης μεταξύ των αποκλινόντων αυτών φαινοτύπων.