Η συμβολή της εξωκυττάριας πρωτεΐνης Fras1 στην ανάπτυξη και λειτουργία του τελικού εγκεφάλου στα ποντίκια

Abstract

The Fras1/Frem protein family of extracellular matrix components comprises of fourmembers, Fras1, Frem1, Frem2 and Frem3. They are principally localized inepithelial basement membranes during embryogenesis, contributing in the structuraland functional conjunction of embryonic epithelium with the subjacent mesenchyme.Nevertheless, Fras1 protein has been implied for a role in development and functionof brain, such as the occasionally exhibited psychomotor/ developmental delay inpatients with Fraser Syndrome. The aim of the present dissertation is to elucidate therole of Fras1 in the brain development and function, focusing on two main axes:determination of its localization profile in the murine brain during development andadulthood, as well as comparative analysis of development, anatomy and function oftelencephalon in the context of differential Fras1 expression.In situ hybridization revealed the Fras1 mRNA expression pattern, which includedcertain domains of embryonic and juvenile telencephalon (G.Chalepakis). Fras1protein was immunohistochemically detected exclusively in embryonic meningealbasement membrane. The localization pattern of Fras1 in the basement membrane wassegmental, overlying particular brain domains. However, Fras1 protein was notdetected inside the neural tissue.Subsequently, certain brain functions were investigated in Fras1-/- mice. Theexamined neural circuits are responsible for the expression of unconditioned andconditioned fear, anxiety and object discrimination. The comparative analysis of fearand anxiety in control and Fras1-/- mice was performed aiming to study the activity ofamygdala. Our results revealed that mutant mice were able to express fear, which isattributed to active medial subnucleus of central amygdala. Nevertheless, thebasolateral amygdala and the lateral subnucleus of central amygdala are possiblyaffected, since the mutant mice were unable to express the auditory conditioned fear.The comparative histological analysis showed that the three examined amygdalarnuclei, which participate in fear circuit, were affected in Fras1-/- mice. The defectswere predominantly localized in the main intercalated nucleus and rostral portion ofcentral amygdala, detected from birth onwards, reminiscent of a potentialdevelopmental phenotype. The aberrant morphology of anterior amygdala in Fras1-/-mice was confirmed utilizing specific neuronal markers, such as Ctip2, Foxp1, Foxp2and Tbr1. The aforementioned defects might cause the alterations as much in auditoryfear conditioning, as in regulation of fear expression in mutant mice.Hippocampus came under investigation, featuring the behavioral experiment of novelobject recognition and histological analysis. Fras1-/- mice displayed normal familiarnovelobject discriminatory ability. However, the comparative histological andmolecular analysis of hippocampus showed a differential arrangement of cornuammonis subdomains in Fras1-/- mice, where CA2 and CA3 subdomains weredorsally extended at the expense of CA1. Furthermore, comparative histological and immunohistochemical analysis wasimplemented in neocortex and piriform. No differences were detected in neocortexbut the parvalbumin positive interneurons were reduced in piriform of adult Fras1-/-mice. Finally, BrdU experiments revealed a slight retardation in brain development ofFras1-/-embryos, as well as affected neuronal migration during late stages ofembryogenesis.Recapitulating the results of the present dissertation, Fras1 protein was exclusivelydetected in meningeal basement membrane during mouse embryogenesis.Nevertheless, the Fras1-/- mice exhibited aberrant morphology of rostral amygdalaand hippocampus during postnatal stages. Furthermore, Fras1-/-adult mice displayedabnormal stress behaviors which are amygdala-dependent. Those findings lead us topostulate a wider role for Fras1 in telencephalon development and function thatremains to be investigated.

Η οικογένεια πρωτεϊνών Fras1/Frem του εξωκυττάριου πλέγματος διαθέτει τέσσεραμέλη, τις Fras1, Frem1, Frem2 και Frem3 με εντοπισμό τις επιθηλιακές βασικέςμεμβράνες κατά την ανάπτυξη στα ποντίκια. Σήμερα, ο ρόλος της συγκεκριμένηςοικογένειας πρωτεϊνών θεωρείται η δομική και η λειτουργική σύζευξη των εμβρυϊκώνεπιθηλίων με το μεσέγχυμα. Ωστόσο, υπάρχουν πλέον μία σειρά από ενδείξεις γιαπιθανή συμβολή της Fras1 στην σωστή ανάπτυξη και λειτουργία του εγκεφάλου. Σταπλαίσια της παρούσας διδακτορικής διατριβής, επιχειρήθηκε ο εντοπισμός τηςπρωτεΐνης Fras1 στον εγκέφαλο των ποντικιών καθώς και μία πολύπλευρη ανάλυσητου τελικού εγκεφάλου των Fras1-/-ποντικιών, μέσω συγκριτικής μελέτης τηςανάπτυξης, της οργάνωσης και της λειτουργίας του.Σύμφωνα με τα αποτελέσματα in situ υβριδοποίησης προέκυψε πως ο τελικόςεγκέφαλος εμβρύων και νεαρών ποντικιών διαθέτει Fras1 μετάγραφα. Με την χρήσητριών διαφορετικών αντισωμάτων της πρωτεΐνης Fras1 έγινε εντοπισμός τηςαποκλειστικά κατά την εμβρυογένεση στην βασική μεμβράνη της μήνιγγας, η οποίαπεριβάλλει το κεντρικό νευρικό σύστημα. Το πρότυπο απόθεσης ήταν κατατετμημένοκαι περιορισμένο σε πολύ συγκεκριμένες περιοχές του εγκεφάλου. Ωστόσο, ηπρωτεΐνη Fras1 δεν ανιχνεύτηκε εντός του νευρικού ιστού με τα χρησιμοποιηθένταπρωτόκολλα.Ακολούθως, πραγματοποιήθηκαν συγκριτικά πειράματα μελέτης της συμπεριφοράςσε φυσιολογικά NMRI και Fras1-/-ποντίκια, με σκοπό να διερευνηθεί ηλειτουργικότητα νευρικών κυκλωμάτων στα συγκεκριμένα μεταλλάγματα. Ταμελετώμενα κυκλώματα ρυθμίζουν διαδικασίες όπως η έκφραση άγχους,εξαρτημένου ή μη εξαρτημένου φόβου και αναγνώριση και διάκριση αντικειμένων.Τα πειράματα εκδήλωσης άγχους και φόβου έγιναν με σκοπό την μελέτη τηςλειτουργίας της αμυγδαλής. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα, υποθέτουμε πως ο έσωυποπυρήνας της κεντρικής αμυγδαλής είναι λειτουργικός στα Fras1-/-ποντίκιαοδηγώντας στην ενορχήστρωση του φόβου. Ωστόσο, παρατηρήθηκε περιορισμένηδυνατότητα απομνημόνευσης του εξαρτημένου φόβου, διεργασία η οποία εξαρτάταιαπό την λειτουργία του έξω βασικού συμπλέγματος της αμυγδαλής και του έξωυποπυρήνα της κεντρικής αμυγδαλής.Η ιστολογική συγκριτική μελέτη της αμυγδαλής ανέδειξε διαταραχή και στους τρειςεξετασθέντες πυρήνες του κυκλώματος φόβου στα Fras1-/-ποντίκια, το έξω βασικόσύμπλεγμα, τον κύριο παρεμβαλλόμενο πυρήνα και την κεντρική αμυγδαλή. Οισημαντικότερες διαταραχές καταγράφηκαν στην πρόσθια μοίρα της κεντρικήςαμυγδαλής και στον κύριο παρεμβαλλόμενο πυρήνα και εντοπίστηκαν σταθερά σεόλες τις ηλικίες μετά την γέννηση. Οι ιστολογικές αποκλίσεις επιβεβαιώθηκαν μεμοριακούς δείκτες, τους Ctip2, Foxp1, Foxp2 και Tbr1. Οι παραπάνω διαταραχές θαμπορούσαν να αποτελούν την κυτταρική και μοριακή αιτία στην αδυναμία της ανάπτυξης εξαρτημένου φόβου και ρύθμιση της καταστολής του φόβου στα Fras1-/-ποντίκια.Παράλληλα, συγκριτικά συμπεριφορικά πειράματα μνήμης και μάθησης συνέβαλανστην μελέτη της λειτουργίας του ιππόκαμπου στα Fras1-/-ποντίκια. Τα αποτελέσματατης ανάλυσης έδειξαν πως τα μεταλλάγματα δεν εμφανίζουν διαταραχή στηναπομνημόνευση και διάκριση αντικειμένων, και συνεπώς ο ιππόκαμπός τουςθεωρείται λειτουργικός. Ωστόσο, η συγκριτική ιστολογική και μοριακή ανάλυση τουιππόκαμπου αποκάλυψε μία διαφοροποίηση στην οργάνωση των υποπεριοχών τουΑμμώνειου Κέρατος των Fras1-/-ποντικιών, καθώς οι CA2 και CA3 υποπεριοχέςεπεκτείνονται ραχιαία εις βάρος της CA1. Η ιστολογική και μοριακή ανάλυσηεπεκτάθηκε στον νεοφλοιό και στον απιοειδή λοβό. Στον νεοφλοιό δενπαρατηρήθηκαν ιστολογικές ή μοριακές διαφορές. Στον απιοειδή λοβό των ενήλικωνFras1-/-ποντικιών καταγράφηκε μία μείωση στην παρουσία των parvalbumin θετικώνενδονευρώνων.Ολοκληρώνοντας, πειράματα με BrdU ανέδειξαν μία ελαφρά καθυστέρηση στηνανάπτυξη των εγκεφάλων κατά την εμβρυογένεση στα Fras1-/-ποντίκια καθώς καιδιαταραχές στην μετανάστευση των νευρώνων κατά τα ύστερα εμβρυϊκάαναπτυξιακά στάδια του εγκεφάλου των συγκεκριμένων ποντικιών.Ανακεφαλαιώνοντας, η πρωτεΐνη Fras1 εντοπίστηκε αποκλειστικά στην βασικήμεμβράνη της μήνιγγας και όχι εντός του νευρικού ιστού. Ωστόσο, τα Fras1-/-ποντίκια διαθέτουν διαταραγμένη διαμόρφωση του ιππόκαμπου και κάποιων εκ τωνπυρήνων της αμυγδαλής. Τα αίτια των διαταραχών θα μπορούσαν να οφείλονται σεπροβλήματα κατά την μορφογένεση του εγκεφάλου. Επιπλέον, εντοπίστηκανδιαταραχές σε συμπεριφορές ενήλικων Fras1-/-ποντικιών, οι οποίες εξαρτώνται απότην σωστή λειτουργία της αμυγδαλής.