Delineating novel innate inflammatory pathways involved in chronic autoinflammatory and autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis and its subtypes like Still’s disease

Abstract

Rheumatoid arthritis (RA) is a chronic immune inflammatory disease characterized by synovial hyperplasia, joint destruction and extra-articular manifestations with a significant impact on both morbidity and mortality. Disease severity correlates with the presence of citrullinated proteins and immune complexes containing various citrullinated antigens which exhibit increased immunogenicity and arthritogenicity. The source of these proteins and immune complexes remains unknown. RA presents local inflammation in the joints, which subsequently develops into a systemic disorder as a result of the loss of immune tolerance. Pathogenic T cells not only help B cells produce auto-Abs (rheumatoid factor (RF) and anti-citrullinated protein, anti-CCPs), but also actively mediate tissue destruction by secreting proinflammatory cytokines (IL-17, IL-6, and TNF-a) thus creating an inflammatory microenvironment that favors macrophage and neutrophil recruitment and osteoclast activation.Dendritic cells (DCs) as professional antigen presenting cells (APCs), migrate to the lymph nodes where they process and present acquired antigens to naïve T cells and secrete cytokines resulting in skewing of naïve T cells toward T helper (Th1, Th17). Emerging data have revealed that the Th1 and Th17 are of the major T cell subsets during the course of RA but what drives their polarization and expansion is unknown. In the clinical setting, neutrophils are present in high numbers in the synovial tissue during the initial stages of RA and persist in the synovial fluid during the perpetuation of the disease. A novel feature of neutrophils, recently described, is their ability to form neutrophil extracellular traps (NETs), a cell death mechanism that is referred as NETosis. NETs are composed of chromatin decorated with a variety of granular proteins. NETs may promote differential cell activation and cytokine release. Aberrant formation of neutrophil extracellular traps (NETs) is a key feature in Rheumatoid arthritis (RA) and has been demonstrated to play a pivotal role in disease pathogenesis. However, the mechanism through which NETs shape the autoimmune response in RA remains elusive. Our aims were: (a) to delineate the role of NETs in shaping the RA autoimmune response, (b) to explore the mechanism involved in the NETs-mediated regulation of the autoimmune response. In this study, we demonstrate that inhibition of peptidylarginine deiminases (PADs) activity in collagen-induced arthritis (CIA) mouse model significantly reduced NET formation, attenuated clinical disease activity and inhibited joint destruction. Importantly, blocking of PADs markedly reduced the frequency of collagen-specific IFN-γ producing Th1 cells in the draining lymph nodes (dLNs) of immunized animals whereas the levels of Th17 cells remained unaffected. Mechanistically, we showed that exposure of DCs to CIA-derived NETs induced DC maturation characterized by significant up-regulation of CD80 and CD86 costimulatory molecules as well as elevated secretion of the inflammatory cytokine IL-6. In support, CIA-NET-treated DCs promoted the induction of antigen-specific Th1 cells in vitro. Finally, RA-derived NETs showed an increased potential to induce the maturation of DCs from healthy individuals corroborating the findings obtained in CIA mouse model. Collectively, our findings delineate an important role of NETs in the induction and expansion of Th1 pathogenic cell subsets in CIA through maturation of DCs. These findings reveal a novel role of NETs in shaping the RA autoimmune response that could be exploited therapeutically.

Η Ρευματοειδής Αρθρίτιδα (ΡΑ) είναι μια χρόνια φλεγμονώδης νόσος που χαρακτηρίζεται από υπερπλασία, καταστροφή των αρθρώσεων και εξωαρθρικές εκδηλώσεις με σημαντική επίδραση στο ρυθμό ανάπτυξης της νόσου και στη θνησιμότητα. Η σοβαρότητα της νόσου σχετίζεται με τη παρουσία αντισωμάτων έναντι κιτρουλλινοποιημένων πρωτεϊνών και ανοσοσυμπλεγμάτων που περιέχουν διάφορα κιτρουλλινοποιημένα αντιγόνα με μεγάλη ανοσογονικότητα και επίδραση στην καταστροφή της άρθρωση. Η πηγή αυτών των αυτοαντιγόνων και η αρχική αιτία απώλειας της ανοσολογικής ανοχής παραμένει άγνωστη.Η ΡΑ παρουσιάζει τοπική φλεγμονή στις αρθρώσεις και σταδιακά αναπτύσεται σε μια συστηματική αυτοάνοση νόσο, αποτέλεσμα της απώλειας ανοχής του ανοσποιητικόυ συστήματος. Παθογόνα Τ κύτταρα όχι μόνο βοηθούν τα Β κύτταρα να παράγουν αυτοαντισώματα (έναντι κιτρουλλινοποιημένων πρωτεϊνών και ρευματοειδείς παράγοντες), αλλά επίσης μεσολαβούν ενεργά στη καταστροφή του ιστού εκκρίνοντας προ-φλεγμονώδεις κυτταροκίνες (IL-17, IL-6, and TNF-a) δημιουργώντας έτσι ένα φλεγμονώδες μικροπεριβάλλον που ευνοεί την προσέλκυση μακροφάγων και ουδετρόφιλων και την ενεργοποίηση των οστεοκλαστών.Τα δενδριτικά κύτταρα ως εξειδικευμένα αντιγονοπαρουσιαστικά κύτταρα, μεταναστεύουν στους λεμφαδένες όπου επεξεργάζονται και παρουσιάζουν αντιγόνα σε μη ενεργοποιημένα Τ κύτταρα και εκκρίνουν κυτταροκίνες καταλήγοντας στη διαφοροποίηση των Τ κυττάρων σε Τ βοηθητικά κύτταρα (Th1, Th17). Διάφορα δεδομένα έχουν αναδείξει τα Τh1 και Th17 ως τους κύριους παθογόνους Τ υποπληθυσμούς κατά τη διάρκεια της ΡΑ. Ωστόσο οι παράγοντες που οδηγούν στη πόλωση και στην ανάπτυξη τους παρανένουν άγνωστοι.Σε κλινικό επίπεδο, τα ουδετερόφιλα βρίσκονται σε υψηλούς αριθμούς στον αρθρικό ιστό κατά τα αρχικά στάδια της ΡΑ και παραμένουν στο αρθρικό υγρό κατά τη πρόοδο της ασθένειας. Ένα νέο χαρακτηριστικό των ουδετερόφιλων που περιγράφηκε πρόσφατα, είναι η ικανότητα τους να σχηματίζουν εξωκυττάριες παγίδες ουδετερόφιλων (NETs), ένας μηχανισμός κυτταρικού θανάτου που αναφέρεται ως Νέτωση. Τα NETs αποτελούνται από DNA-χρωματίνη που είναι διακοσμημένη από μια ποικιλία πρωτεϊνών που βρίσκονται στα κοκκία των ουδετερόφιλων. Τα NETs μπορούν να προκαλέσουν κυτταρική ενεργοποίηση σε διάφορα κύτταρα και την έκκριση κυτταροκινών.Ένα σημαντικό χαρακτηριστικό της ΡΑ είναι ο παθολογικός σχηματισμός NETs και έχει δειχθεί να παίζει σημαντικό ρόλο στη παθογένεια της ασθένειας. Ωστόσο, ο μηχανισμός μέσω του οποίου τα NETs συμμετέχουν στην αυτοάνοση απάντηση στη ΡΑ, παραμένει άγνωστος. Οι στόχοι της παρούσας ερευνητικής μελέτης ήταν: (α) η διερεύνηση του ρόλου των NETs στην αυτοάνοση απόκριση της ΡΑ,(β) η μελέτη τωνμηχανισμών ρύθμισης της αυτοάνοσης απόκρισης από τα NETs.Στη παρούσα μελέτη, δείχνουμε ότι η καταστολή της δράσης των PAD ενζύμων (κύρια ένζυμα κατά τη κιτρουλλινοποίηση) στο μοντέλο ποντικού με αρθρίτιδα επαγώμενη από κολλαγόνο μείωσε σημαντικά τη δημιουργία των NETs, τη κλινική ενεργότητα της ασθένειας και παρεμπόδισε τη καταστροφή της άρθρωσης. Το σημαντικότερο είναι οτι αναστέλλοντας τα ένζυμα PAD μειώθηκε σημαντικά η συχνότητα των αντιγονοειδικών Τ κυττάρων που παράγουν IFN-γ (Th1) στους επιχώριους λεμφαδένες (dLNs) ανοσοποιημένων ποντικών ενώ τα επίπεδα των κυττάρων που παράγουν IL-17 (Th17) παρέμειναν σταθερά. Λειτουργικά δείξαμε οτι η έκθεση των δενδριτικών κυττάρων σε NETs προερχόμενα από ποντίκια με νόσο επέφερε την ενεργοποίηση των δενριτικών κυττάρων συνοδευόμενη από αύξηση των μορίων συν-ενεργοποίησης CD80 και CD86 και από αυξημένη έκκριση της προφλεγμονώδους κυτταροκίνης IL-6. Επίσης, τα δενδριτικά κύτταρα που συγκαλλιεργήθηκαν με NETs (CIA-NETs) αύξησαν τα αντιγονοειδικά Th1 κύτταρα in vitro. Τέλος, τα NETs προερχόμενα από ασθενείς με ΡΑ αύξησαν την ενεργοποίηση υγιών δενδριτικών κυττάρων συμφωνώντας με τα ευρήματα στο πειραματικό μοντέλο ΡΑ.Συνολικά, τα δεδομένα αυτά αποκαλύπτουν ένα σημαντικό ρόλο των NETs στην επαγωγή του Th1 κυτταρικού υποπληθυσμού στο μοντέλο ποντικού αρθρίτιδας επαγώμενης από κολλαγόνο (Collagen-induced arthritis) μέσω της ενεργοποίησης των δενδριτικών κυττάρων. Αυτά τα ευρήματα αποκαλύπτουν ένα καινοτόμο ρόλο των NETs στη δημιουργία αυτοάνοσων αποκρίσεων στη ΡΑ που μπορεί να διερευνηθεί θεραπευτικά.