Μελέτη των μονοπατιών σηματοδότησης των προϊόντων προχωρημένης γλυκοζυλίωσης (AGEs) σε κύτταρα ωοθήκης και ενδοθηλίου

Abstract

Advanced glycation products (AGEs) are highly reactive molecules, which are formed from theinherently non-enzymatic glycosylation of proteins, lipids and nucleic acids or derived fromexogenous sources. The formation of AGEs has been implicated in the pathogenesis of diabeticcomplications, neurodegenerative disorders, aging and atherosclerosis and inflammation andmore recently in polycystic ovary syndrome (PCOS). The interaction of AGEs with their receptorRAGE activates intracellular signaling pathways that are involved in endothelial andreproductive dysfunction, conditions that characterize PCOS. The study involvedactivation/phosphorylation of specific intracellular target proteins of the signaling pathway ofAGEs, specifically ERK1/2 and c-JUN, in cultured endothelial cells from umbilical vein(HUVECs) of normal women, women with PCOS and gestastional diabetes after administrationof AGE-modified bovine serum albumin (AGE/BSA). It was observed that AGEs treatment ofendothelial cells from PCOS resulted in a statistically significant activation of c-JUN. The sameinvestigation was also conducted in cell cultures from rat ovaries (theca cells) where bothkinases ERK1/2 and c-JUN were specifically activated after administration of AGEs. Then weinvestigated the involvement of the AGEs induced transcription factors NF-κB (Nuclear Factor-κB) and AP-1 (Activator Protein-1) in human aortic endothelial cells (HAECs, Human AorticEndothelial Cells) in the gene regulation of endothelin-1 (ET-1) and lysine oxidase (LOX). AGEBSAadministration in HAECs significantly induced gene transcription of ET-1 and LOX in atime-and dose-dependent manner and their protein expression. This induction is mediated bybinding and activation of the transcription factors NF-kappaB and AP-1 in the promoters of bothgenes. Furthermore, immunohistochemical investigation of normal aortic endothelium from ratsthat had received high in AGEs-diet showed increased expression and colocalization of AGEs,RAGE, ET-1 and LOX in the same areas. In parallel, the effect of AGEs on the induction ofendoplasmic reticulum stress (ER stress) was also investigated in endothelial cells. AGE-BSAadministration significantly decreased proliferation of HAECs at a dose- and time-dependentmanner, while there was an immediate induction of molecular chaperons, GRP78, GRP94, whichare representative markers of ER stress induction. In addition of proapoptotic transcriptionfactor, CHOP was associated with the increased number of apoptotic cells. The present studyshows induction of LOX and ET-1expression via activation of AGE-RAGE axis and its generegulation through transcription factors NF-κB and AP-1 shows for the first time the directinduction of ER stress by AGEs in human aortic endothelial cells revealing potentialintracellular molecular mechanisms that contribute to endothelial dysfunction.

Τα προϊόντα προχωρημένης γλυκοζυλίωσης (Advanced Glycation End products, AGEs) είναιμόρια υψηλής δραστικότητας, τα οποία σχηματίζονται ενδογενώς από την μη ενζυματικήγλυκοζυλίωση πρωτεϊνών, λιπιδίων και νουκλεϊκών οξέων ή προέρχονται από εξωγενείςπηγές. Ο σχηματισμός των AGEs έχει ενοχοποιηθεί στην παθογένεια των διαβητικώνεπιπλοκών, νευροεκφυλιστικών διαταραχών, του γήρατος και της αρτηριοσκλήρυνσης, τηςφλεγμονής και πρόσφατα του συνδρόμου των πολυκυστικών ωοθηκών (ΣΠΩ). Ηαλληλεπίδραση των ΑGEs με τον υποδοχέα τους RAGE ενεργοποιεί ενδοκυτταρικάσηματοδοτικά μονοπάτια τα οποία ενέχονται στην ενδοθηλιακή και αναπαραγωγικήδυσλειτουργία, καταστάσεις που χαρακτηρίζουν σε μεγάλο βαθμό το ΣΠΩ. Για το σκοπό αυτόπραγματοποιήθηκε μελέτη της ενεργοποίησης/φωσφορυλίωσης συγκεκριμένωνενδοκυττάριων πρωτεϊνών-στόχων του σηματοδοτικού μονοπατιού των AGEs πουπεριλαμβάνουν την ERK1/2 και την c-JUN σε καλλιέργειες ενδοθηλιακών κυττάρων από φλέβαομφαλίου λώρου (Human Umbilical Vein Endothelial-cells, HUVECs) φυσιολογικών γυναικών,γυναικών με ΣΠΩ και Σακχαρώδη Διαβήτη τύπου ΙΙ μετά από χορήγηση AGE-τροποποιημένηςαλβουμίνης βόειου ορού (AGE-bovine serum albumin, AGE/BSA). Παρατηρήθηκε ότι ηχορήγηση των AGEs οδήγησε σε στατιστικά σημαντική ενεργοποίηση της c-JUN σταενδοθηλιακά κύτταρα από ΣΠΩ. Η ίδια διερεύνηση πραγματοποιήθηκε και σε καλλιέργειεςκυττάρων θήκης από επίμυες, όπου και οι δύο κινάσες ERK1/2 και c-JUN, μετά από χορήγησητων AGEs ενεργοποιήθηκαν ειδικά μέσω φωσφορυλίωσης. Στη συνέχεια διερευνήθηκε ησυμμετοχή των επαγόμενων από τα AGEs μεταγραφικών παραγόντων NF-κΒ (Nuclear Factor-κΒ) και AP-1 (Activator Protein-1) σε ανθρώπινα ενδοθηλιακά κύτταρα αορτής (HAECs, HumanAortic Endothelial Cells) στη γονιδιακή ρύθμιση της ενδοθηλίνης-1 (ET-1, endothelin-1) και τηςοξειδάσης της λυσίνης (lysyl oxidase, LOX). Η χορήγηση AGE-BSA σε καλλιέργειες HAECsεπάγει σημαντικά τη μεταγραφή των γονιδίων της ΕΤ-1 και της LOX κατά ένα χρονο- και δοσο-εξαρτώμενο τρόπο καθώς και την πρωτεϊνική τους έκφραση. Η επαγωγή αυτή μεσολαβείταιαπό την ενεργοποίηση και πρόσδεση στους υποκινητές και των δύο γονιδίων τωνμεταγραφικών παραγόντων NF-κΒ και AP-1. Επιπλέον, η ανοσοϊστοχημική διερεύνηση τουενδοθηλίου της αορτής φυσιολογικών επίμυων που είχαν λάβει δίαιτα υψηλής περιεκτικότηταςσε AGEs έδειξε υψηλή έκφραση και συνεντοπισμό των ΑGEs, RAGE, ET-1 και LOX. Παράλληλα, μελετήθηκε η πιθανή επίδραση των AGEs στην επαγωγή του Στρες του ΕνδοπλασματικούΔικτύου (ΕΔ) και των εμπλεκόμενων σηματοδοτικών μορίων. Η χορήγηση AGE-BSA ελάττωσεστατιστικά σημαντικά τον πολλαπλασιασμό των HAECs κατά ένα δόσο- και χρόνο εξαρτώμενοτρόπο ενώ παρατηρήθηκε άμεση επαγωγή των μοριακών συνοδών, δεικτών, της επαγωγήςτου στρες του ΕΔ (GRP78, GRP94). Δείχθηκε επίσης η μετέπειτα επαγωγή τουπροαποπτωτικού μεταγραφικού παράγοντα CHOP που σχετίστηκε και με αυξημένο αριθμόαποπτωτικών κυττάρων. Η παρούσα διατριβή έδειξε την επαγωγή της έκφρασης των LOX καιΕΤ-1 μέσω ενεργοποίησης του άξονα AGE-RAGΕ καθώς και τη γονιδιακή τους ρύθμιση απότους μεταγραφικούς παράγοντες NF-κΒ και AP-1 καθώς, επίσης, έδειξε για πρώτη φορά τηνάμεση επαγωγή από τα AGEs του στρες του ΕΔ σε ανθρώπινα αορτικά ενδοθηλιακά κύτταρα,αποκαλύπτοντας πιθανούς ενδοκυττάριους μοριακούς μηχανισμούς που συμβάλλουν στηνενδοθηλιακή δυσλειτουργία.