Microbial production of poly(hydroxyalkanoates) and biorefinery development using by-product streams from sunflower-based biodiesel production processes

Abstract

The scope of this thesis is the evaluation of by-product streams deriving from a sunflower-based biodiesel production process, namely sunflower meal and crude glycerol, for the development of a biorefinery concept for the microbial production of poly(hydroxyalkanoates) and value-added products. The study was initiated with the utilisation of sunflower meal for the production of fermentation media in a two stage bioprocess. Sunflower meal was utilised as substrate for the production of crude enzyme consortia through solid state fermentation using the fungal strain Aspergillus oryzae. Fermented solids were subsequently mixed with unprocessed sunflower meal aiming at the production of a nutrient-rich fermentation feedstock. The highest free amino nitrogen and inorganic phosphorus concentrations achieved were 1.5 g/L and 246 mg/L, respectively, using an initial proteolytic activity of 6.4 U/mL. The FAN concentration increased to 2.3 g/L when the initial proteolytic activity was increased to 16 U/mL. Sunflower meal hydrolysates were mixed with crude glycerol to provide fermentation media for the production of poly(hydroxybutyrate) (PHB) using the bacterial strain Cupriavidus necator DSM 7237. Fed-batch bioreactor fermentations led to the production of 27 g/L PHB with an intracellular content of 72.9% (w/w), that was slightly improved (32.6 g/L PHB) when different bioprocessing strategies were implemented. The effect of levulinic acid as precursor for poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) P(3HB-co-3HV) synthesis was evaluated in shake flasks and bioreactor cultures. Continuous feeding of levulinic acid led to the production of up to 23.4 g/L P(3HB-co-3HV) with an intracellular content of 66.4% (w/w) and a 3HV content of 22.5 mol%. Subsequently, aiming to generate diversified end-products, sunflower meal was used for the production of an antioxidant-rich fraction, protein isolate and nutrient-rich fermentation supplements. The ethanolic extract from the sunflower meal presented high antioxidant activity, as it was measured by the DPPH• method. The protein isolate formulated after alkaline treatment followed by acidic precipitation at the isoelectric point had a purity higher than 95% (w/w). The remaining solid and liquid streams from SFM fractionation were employed in the production of nutrient-rich hydrolysates, combined with, crude glycerol and evaluated in fed-batch bioreactor fermentations for the production of 57 g/L of PHB with an intracellular content of 86.2% (w/w), entailing a conversion yield of 0.47 g/g.To extend the sustainability of the proposed biorefinery concept, a preparation rich in crude enzyme produced via SSF using the fungal strain A. oryzae was used to lyse cells of C. necator, enabling the recovery of intracellular biopolymer. The highest enzymatic lysis of bacterial cells was achieved at 48 °C and uncontrolled pH leading to recovery yield and purity of 98% and 96.7%, respectively. The bacterial biopolymers were characterised concerning the thermal properties and molecular weight. A preliminary techno-economic evaluation was performed to evaluate the costs associated with the production of antioxidants, protein isolate and PHB in the integrated sunflower-based biorefinery concept. Overall, it was demonstrated that process economics are significantly affected by the final market value depending on the end-uses of the protein isolate and the crude antioxidant-rich extract.

Ο σκοπός της παρούσας διδακτορικής διατριβής έγκειται στην αξιοποίηση των αποβλήτων της διεργασίας παραγωγής βιοντίζελ με βάση τον ηλίανθο, και ειδικότερα το ηλιάλευρο (ή ηλιόπιτα) και την ακάθαρτη γλυκερόλη, ως ανανεώσιμες πρώτες ύλες για την ανάπτυξη βιο-διυλιστηρίου προς την παραγωγή πολυ-υδροξυαλκανοϊκών εστέρων. Αρχικά πραγματοποιήθηκε η χρησιμοποίηση του ηλιαλεύρου προς την παραγωγή ενός θρεπτικού υποστρώματος για μικροβιακές ζυμώσεις μέσω μιας βιοδιεργασίας δύο σταδίων. Το ηλιάλευρο χρησιμοποιήθηκε ως υπόστρωμα σε ζύμωση στερεάς κατάστασης για την παραγωγή ακατέργαστων ενζύμων με το μυκητιακό στέλεχος Aspergillus oryzae. Εν συνεχεία, τα ζυμούμενα στερεά αναμίχθηκαν με ακατέργαστο ηλιάλευρο με απώτερο στόχο την παραγωγή ενός πλούσιου θρεπτικού υποστρώματος για μικροβιακές ζυμώσεις. Η υψηλότερη συγκέντρωση σε άζωτο ελεύθερων αμινομάδων και αμινοξέων (free amino nitrogen, FAN) και ανόργανου φωσφόρου που επετεύχθησαν ήταν 1.5 g/L και 246 mg/L, αντίστοιχα, εφαρμόζοντας αρχική πρωτεολυτική ενεργότητα 6.4 U/mL. Η συγκέντρωση του FAN αυξήθηκε σε 2.3 g/L στην περίπτωση κατά την οποία αυξήθηκε η αρχική πρωτεολυτική ενεργότητα σε 16 U/mL. Τα υδρολύματα του ηλιαλεύρου αναμίχθηκαν με την ακάθαρτη γλυκερόλη ώστε να προκύψει θρεπτικό μέσο ζύμωσης που αξιοποιήθηκε για την παραγωγή πολυ-υδροξυβουτυρικού εστέρα (PHB) χρησιμοποιώντας το βακτηριακό στέλεχος Cupriavidus necator DSM 7237. Οι ζυμώσεις ημι-διαλείποντος έργου σε βιοαντιδραστήρα οδήγησαν στην παραγωγή 27 g/L PHB με ενδοκυτταρικό ποσοστό βιοπολυμερούς 72.9% (w/w), το οποίο βελτιώθηκε όταν εφαρμόστηκαν διαφορετικές στρατηγικές και σχεδιασμός στη βιοδιεργασία (32.6 g/L PHB). Η επίδραση του λεβουλινικού οξέος ως πρόδρομη ένωση για τη σύνθεση πολυ-(3-υδροξυβουτυρικού-co-3-υδροξυβαλερικού), P(3HB-co-3HV), αξιολογήθηκε κατά τη διάρκεια ζυμώσεων σε αναδευόμενες κωνικές φιάλες και σε βιοαντιδραστήρα. Η συνεχόμενη τροφοδοσία με λεβουλινικό οξύ συνετέλεσε στην παραγωγή έως και 23.4 g/L P(3HB-co-3HV) με ενδοκυτταρικό ποσοστό βιοπολυμερούς 66.4% (w/w) με το ποσοστό του 3HV να ισούται με 22.5 mol%. Εν συνεχεία, υπό το πρίσμα της παραγωγής μιας πληθώρας διαφορετικών τελικών προϊόντων στα πλαίσια του βιο-διυλιστηρίου, το ηλιάλευρο χρησιμοποιήθηκε για την παραγωγή ενός κλάσματος πλούσιο σε αντιξειδωτικά, απομονωμένης πρωτεΐνης υψηλής καθαρότητας και θρεπτικών υποστρωμάτων για μικροβιακές ζυμώσεις. Τα αιθανολικά εκχυλίσματα του ηλιαλεύρου παρουσίασαν υψηλή αντιοξειδωτική ικανότητα σύμφωνα με τις μετρήσεις της μεθόδου DPPH•. Η απομονωμένη πρωτεΐνη που παρήχθησε έπειτα απο την επεξεργασία με αλκαλικά διαλύματα ακολοθούμενη απο όξινη κατακρήμνιση, χαρακτηρίστηκε απο καθαρότητα υψηλότερη από 95% (w/w). Τα εναπομείναντα υγρά και στερεά ρεύματα από το διαχωρισμό-κλασμάτωση του ηλιαλεύρου εφαρμόστηκαν σε διεργασία παραγωγής θρεπτικών υποστρωμάτων για μικροβιακές ζυμώσεις, μέσω της παραγωγής ακατέργαστων ενζύμων για την ενζυμική υδρόλυση των υπολοίπων ρευμάτων. Αντίστοιχα, τα πλούσια σε θρεπτικά υδρόλυματα αναμίχθηκαν με την ακατέργαστη γλυκερόλη ως πηγή άνθρακα και εξιολογήθηκαν σε ζυμώσεις ημι-διαλείποντος έργου για την παραγωγή 57 g/L PHB με εσωκυττάριο ποσοστό βιοπολυμερούς 86.2% (w/w), συνεπάγοντας συντελεστή μετατροπής ίσο με 0.47 g/g.Ακολούθως, με απώτερο σκόπο τη διεύρυνση της βιωσιμότητας του προτεινόμενου βιο-διυλιστηρίου, παρήχθησε μέσω ζύμωσης στερεάς κατάστασης με το μύκητα A. oryzae ένα εκχύλισμα ακατέργαστων ενζύμων, το οποίο εφαρμόστηκε στην ενζυμική λύση των κυττάρων του στελέχους C. necator, καθιστώντας δυνατή την ανάκτηση του ενδοκυτταρικού βιοπολυμερούς. Το υψηλότερο ποσοστό ενζυμικής λύσης των βακτηριακών κυττάρων επετεύχθη σε θερμοκρασία 48 °C και μη ελεγχόμενη τιμή pH, συνεπάγοντας ποσοστό ανάκτησης και καθαρότητας ίσο με 98% και 96.7%, αντίστοιχα. Το υδρολυμένο βακτηριακό διάλυμα που προέκυψε μετά το διαχωρισμό των μορίων του P(3HB-co-3HV) αξιολογήθηκε ως θρεπτικό υπόστρωμα σε συνδυασμό με την ακάθαρτη γλυκερόλη για τη συσσώρευση PHB κατά τη διάρκεια ζυμώσεων σε αναδευόμενες κωνικές φιάλες. Επιπρόσθετα, τα βακτηριακά βιοπολυμερή χαρακτηρίστηκαν αναφορικά με τις θερμικές ιδιότητες και το μοριακό τους βάρος. Μια προκαταρκτική τεχνο-οικονομική μελέτη πραγματώθηκε προκειμένου να αξιολογηθεί το κόστος που σχετίζεται με την παραγωγή των αντιοξειδωτικών, της πρωτεΐνης υψηλής καθαρότητας και του PHB στα πλαίσια του προτεινόμενου βιο-διυλιστηρίου. Εν κατακλείδι, τεκμαίρεται ότι η οικονομική βιωσιμότητα της διεργασίας είναι άμεσα σχετιζόμενη με την τελική τιμή αγοράς και εξαρτάται απο τις τελικές χρήσεις της απομονωμένης πρωτεΐνης και του εκχυλίσματος των αντιοξειδωτικών