In vitro μελέτη του ρόλου των αυξητικών παραγόντων στον πολλαπλασιασμό, μετανάστευση και διήθηση κυττάρων οστεοσαρκώματος

Abstract

Backround: Osteosarcoma is the most common malignant bone tumor in childrenand adolescents, with frequency 4,4 / 1000000. Despite the significant increase in thesurvival rate of patients with osteosarcoma over the past decades, due to earlydiagnosis and the use of chemotherapy, the tumor cell pathophysiology remainslargely unknown and the presence of metastases continues to be a major negativeprognostic factor.Complex interactions between cancer cells, the extracellular matrix (ECM) and theadjacent normal cells play an important role in development and tumor progression.ECM composition affects important functions of normal and tumor cells, such asproliferation, adhesion, migration and differentiation. One of the main components ofthe extracellular matrix and cell membrane are proteoglycans (PGs), through whichtheir protein core or through their glycosaminoglycans (GAGs) chains are capableto interact with macromolecules of the extracellular matrix such as collagen, growthfactors, growth factor receptors and adhesion molecules , participating in this way tothe regulation of various cellular functions.Parathyroid hormone (PTH) as either an endogenous produced hormone or anadministered antiosteoporotic factor plays a key role in the physiology ofbone. However it remains largely unknown the importance of PTH action in primarybone tumors such as osteosarcomaAim: To study the effect of different parathyroid hormone peptides in the migration ofhuman osteosarcoma cell lines and to identify possible changes of the extracellularmatrix induced by PTH peptides that affect the migratory capacity of these cells. Moreover, the investigation of potential extracellular and intracellular signalingpathways that may regulate this specific cellular functionResults: we investigated whether the changes of HA metabolism induced by PTH (1–34) and PTH (7–84) peptides in moderately MG-63 and well-differentiated Saos 2osteosarcoma cell lines, are correlated to their migration capabilities. Our resultsdemonstrate that intermittent PTH (1–34) treatment significantly (P ≤ 0.01) supportedthe migration of MG-63 cells, increased their HA-synthase-2 (HAS2) expression (P≤0.001), and enhanced their high-molecular size HA deposition in the pericellularmatrix. Both increased endogenous HA production (P ≤ 0.01) and treatment withexogenous high-molecular weight HA (P ≤ 0.05) correlated to a significant increaseof MG-63 cell migration capacity. Transfection with siHAS2 showed that PTH (1–34), mainly through HAS2, enhanced HA and regulated MG-63 cell motility.Interestingly, continuous PTH (1–34) treatment stimulated both Saos 2 cell HAS2 (P≤0.001) and HAS1 (P ≤ 0.001) isoform expression inhibited their HYAL2 expression(P ≤ 0.001) and modestly (P ≤ 0.05) enhanced their migration. Therefore, the PTH (1–34) administration mode appears to distinctly modulate the migratory responses of theMG-63 moderately and Saos 2 well-differentiated osteosarcoma cell lines.Conclusively, the obtained data suggest that there is a regulatory effect of PTH (1–34), in an administration mode-dependent manner, on HA metabolism that is essentialfor osteosarcoma cell migration. Then we wanted to investigate the participation ofother potential pathways through which PTH(1-34) regulates the migratory capacityof osteosarcoma cells, through regulation of the composition of the extracellular andpericellular space. Thus, we investigated the possible participation of FGF-2 signalingin PTH(1–34)-dependent osteosarcoma cell migration. FGF-2 treatment of osteosarcoma cells resulted in a significant increase (P ≤ 0.01) in MG63 cellmigration, similar to that caused by PTH(1–34). mRNA expression analysis of cellstreated with PTH(1–34) showed a strong increase in FGF-2 transcript levels (P =0.0015). Interestingly, the addition of FGF-2 to MG63 cells led to significantdownregulation of small leucine-rich proteoglycan biglycan expression at both themRNA (P ≤ 0.0001) and protein (60%) levels. In order to examine the significance ofbiglycan on MG63 cell migration, transfection with short interfering RNA specific forbiglycan was performed, resulting in a significant increase (P ≤ 0.01) in the migrationcapacity of biglycan-deficient MG63 cells. In contrast, exogenous humanrecombinant biglycan strongly inhibited the migration of these cells (P ≤ 0.01).Finally, a direct correlation between PTH(1–34) action and biglycan expression wasestablished by the finding of a significant decrease (P ≤ 0.01) in biglycan transcriptlevels in PTH(1–34)-treated cells. To summarize, the present study demonstrates anovel cooperative mechanism of PTH(1–34) and FGF-2 action that results in specificalteration of the biglycan extracellular matrix content to regulate osteosarcoma cellmigration.. Taking into consideration the importance of TGFb in bone biology and theregulatory effect of the biglycan on TGFb action, in order to determine the necessityof TGF b for cell migration we created MG 63 biglycan-deficient osteosarcoma cells.We treated these cells with an antibody against TGFb and we found that whilebiglycan-deficient cells increased their migration capacity (P <0.01), biglycandeficientcells which were treated with the anti - TGFb1 antibody failed to increasetheir migration activity. These results show the importance of TGFb1 in migrationcapacity of MG63 cells .It has been shown that syndecan 4 plays an important role inthe biology of different tumor cells and that this role is achieved through complexFGFR / syndecan 4 interactions. We sought to determine the importance of syndecan4 in MG63 osteosarcoma cell migration. We proceeded to create MG 63 cellsdeficient in syndecan 4 (siSynd 4) in which we administered FGF 2 and found thatthey did not show the expected increase in their ability to migrate. Thereby shownthat syndecan 4 is an essential molecule in the mechanism in which the FGF -2achieves increased cell migration of MG 63 cells.Conclusions: With this study we identified two possible pathways through whichPTH (1-34) achieves its action on migration ability of osteosarcoma cells.1st Pathway: PTH (1-34) controlling the metabolism of hyaluronic acid (HA)increases the migratory ability of osteosarcoma cells.2nd Pathway: PTH (1-34) controlling the synthesis of biglycan through regulation ofFGF2 expression, manages to alter migration ability of osteosarcoma cells. Syndecan4is an essential component for the action of FGF2 in this pathway.

Υπόβαθρο: Το οστεοσάρκωμα είναι ο πιο συχνός κακοήθης όγκος των οστών σταπαιδιά και τους εφήβους, με συχνότητα 4,4/1000000. Παρά την σημαντική αύξησητου ποσοστού επιβίωσης των ασθενών με οστεοσάρκωμα τις τελευταίες δεκαετίες,γεγονός που οφείλεται στην έγκαιρη διάγνωση και την χρήση της χημειοθεραπείας, ηκυτταρική παθοφυσιολογία του όγκου παραμένει σε μεγάλο βαθμό άγνωστη και ηπαρουσία μεταστάσεων εξακολουθεί να αποτελεί ένα σημαντικότατο αρνητικόπρογνωστικό παράγοντα.Σημαντικό ρόλο στην ανάπτυξη και την εξέλιξη των όγκων έχουν οι σύνθετεςαλληλεπιδράσεις μεταξύ των καρκινικών κυττάρων, του εξωκυτταρίου χώρου (ECM)και των γειτονικών φυσιολογικών κυττάρων. Η σύσταση της ECM επηρεάζεισημαντικές λειτουργίες των φυσιολογικών και των καρκινικών κυττάρων, όπως οπολλαπλασιασμός, η προσκόλληση, η μετανάστευση και η διαφοροποίηση. Ένα απότα κύρια συστατικά του εξωκυττάριου χώρου και της κυτταρικής μεμβράνης είναι οιπρωτεογλυκάνες (PGs), οι οποίες μέσω του πρωτεϊνικού τους κορμού ή διαμέσου τωνγλυκοζαμινογλυκανικών (GAGs) τους αλυσίδων, είναι ικανές να αλληλεπιδρούν μεμακρομόρια του εξωκυττάριου χώρου, όπως το κολλαγόνο, οι αυξητικοί παράγοντες,οι υποδοχείς των αυξητικών παραγόντων και τα μόρια προσκόλλησης,συμμετέχοντας με τον τρόπο αυτό στη ρύθμιση των κυτταρικών λειτουργιών.Η παραθυρεοειδής ορμόνη είτε ως μια ενδογενώς παραγόμενη ορμόνη είτε ωςένας εξωγενώς χορηγούμενος αντιοστεοπορωτικός παράγοντας διαδραματίζεικομβικό ρόλο στην φυσιολογία του οστού. Ωστόσο παραμένει εν πολλοίς άγνωστη ησημασία της δράσης της σε πρωτογενής όγκους των οστών όπως το οστεοσάρκωμαΣκοπός: η μελέτη της επίδρασης τμημάτων της παραθυρεοειδούς ορμόνης στηνμετανάστευση κυτταρικών σειρών οστεοσαρκώματος ανθρώπου καθώς και ο προσδιορισμός των αλλαγών εκείνων του εξωκυτταρίου χώρου που επάγονται απόαυτήν και μεταβάλουν την μεταναστευτική ικανότητα αυτών των κυττάρων. Επίσης ηδιερεύνηση των πιθανών εξωκυττάριων και ενδοκυττάριων μονοπατιώνσηματοδότησης που επιδρούν στη ρύθμιση της συγκεκριμένης κυτταρικήςλειτουργίαςΑποτελέσματα: Στα πλαίσια της παρούσας έρευνας μελετήθηκε εάν οι αλλαγές τουμεταβολισμού του υαλουρονικού (ΗΑ) που επάγονται από τα πεπτίδια ΡΤΗ ( 1-34)και ΡΤΗ (7-84) της παραθορμόνης, σε μετρίως (MG63) και καλά διαφοροποιημένες(Saos 2) κυτταρικές σειρές οστεοσαρκώματος, συσχετίζονται με την μεταναστευτικήικανότητα των κυττάρων αυτών. Τα αποτελέσματά μας αποδεικνύουν ότι ηδιαλείπουσα χορήγηση ΡΤΗ (1-34) οδήγησε σε σημαντική αύξηση (Ρ ≤0,01 ) τηςμετανάστευσης των κυττάρων MG63, αύξηση της έκφρασης της συνθάσης του ΗΑ,ΗΑS-2 (Ρ ≤0,001) και στην ενισχυμένη εναπόθεση υψηλού μοριακού βάρους ΗΑστον περικυττάριο χώρο. Τόσο η αύξηση της ενδογενούς παραγωγής ΗΑ (Ρ ≤0,01)όσο και η εξωγενής χορήγηση υψηλού μοριακού βάρους ΗΑ βρέθηκαν νασυσχετίζονται (Ρ ≤0,05) με μία σημαντική αύξηση της μεταναστευτικής ικανότηταςτης κυτταρικής σειράς MG63. Επιμόλυνση με siHAS2 έδειξε ότι η ΡΤΗ (1-34),κυρίως μέσω της HAS2, ενισχύει την παραγωγή του ΗΑ και ρυθμίζει την κυτταρικήκινητικότητα των MG63 κυττάρων. Είναι ενδιαφέρον ότι, η συνεχής χορήγηση ΡΤΗ(1-34) διεγείρει στα Saos 2 κυττάρα την έκφραση της HAS2 (Ρ ≤0,001) και της HAS1(Ρ ≤ 0,001 ) ισομορφής, ενώ αναστέλλει την έκφραση της υαλουρονιδάσης-2(HYAL2) (Ρ ≤0,001) και ενισχύει μέτρια τη μετανάστευσή τους (Ρ ≤ 0,05). Ως εκτούτου, η ΡΤΗ (1-34) κατά τρόπο που εξαρτάται από την μέθοδο χορήγησης τηςφαίνεται να ρυθμίζει σημαντικά την μεταναστευτική ικανότητα των MG63 και Saos2κυτταρικών σειρών οστεοσαρκώματος. Συμπερασματικά, τα δεδομένα που προκύπτουν αναδεικνύουν την ύπαρξη μιας ρυθμιστικής επίδρασης της ΡΤΗ (1-34),κατά ένα χρονικά εξαρτώμενο τρόπο χορήγησης, στον μεταβολισμό του ΗΑ γεγονόςπου οδηγεί σε μεταβολές στη μετανάστευση των κυττάρων οστεοσαρκώματος.Κατόπιν θελήσαμε να ερευνήσουμε την συμμετοχή και άλλων πιθανών μονοπατιώνδιαμέσου των οποίων η ΡΤΗ (1-34) ρυθμίζει την μεταναστευτική ικανότητα τωνκυττάρων του οστεοσαρκώματος προξενώντας μεταβολές στην σύνθεση τουεξωκυτταρίου και περικυτταρίου χώρου. Έτσι, ερευνήσαμε την πιθανή συμμετοχήτης σηματοδότησης του FGF2 (αυξητικός παράγοντας ινοβλαστών 2) στην ΡΤΗ (1-34)-εξαρτώμενη κυτταρική μετανάστευση του οστεοσαρκώματος. Η χορήγηση FGF2σε κύτταρα οστεοσαρκώματος οδήγησε σε σημαντική αύξηση (P ≤ 0,01) τηςκυτταρικής μετανάστευσης των MG63, παρόμοια με εκείνη που προκαλείται από τηνΡΤΗ (1-34). Η mRNA ανάλυση της έκφρασης των κυττάρων στα οποία χορηγήθηκεΡΤΗ (1-34) έδειξε μία έντονη αύξηση του FGF2, σε επίπεδο μεταγραφής (Ρ =0,0015). Είναι ενδιαφέρον ότι η προσθήκη του FGF2 σε κύτταρα MG63 οδήγησε σεσημαντική καταστολή της έκφρασης της διγλυκάνης, μιας μικρής πλούσιας σελευκίνη πρωτεογλυκάνης, τόσο σε επίπεδο mRNA (P ≤ 0,0001) όσο και σε επίπεδοπρωτεΐνης (60%). Προκειμένου να εξεταστεί η σημασία της διγλυκάνης στηνκυτταρική μετανάστευση των MG63 κυττάρων πραγματοποιήθηκε επιμόλυνση μεsiRNA ειδικών για την διγλυκάνη, με αποτέλεσμα τη σημαντική αύξηση (P ≤ 0,01)στην ικανότητα μετανάστευσης των κύτταρων αυτών. Σε αντίθεση, η εξωγενήςχορήγηση ανθρώπινης ανασυνδυασμένης διγλυκάνης ανέστειλε έντονα τηνμετανάστευση αυτών των κυττάρων (P ≤ 0,01). Τέλος, διαπιστώθηκε μια άμεσησυσχέτιση μεταξύ της δράσης της PTH (1-34) και της έκφρασης της διγλυκάνης μεσημαντική μείωση (P ≤ 0,01) σε επίπεδο μεταγραφής της διγλυκάνης στα κύτταραστα οποία χορηγήθηκε PTH (1-34). Συνοπτικά, η παρούσα μελέτη αποδεικνύει ένα νέο συνεργικό μηχανισμό δράσης της ΡΤΗ (1-34) με τον FGF2 που οδηγεί σεμεταβολές της παρουσίας της διγλυκάνης στον εξωκυττάριο χώρο, οι οποίες με τηνσειρά τους προξενούν μεταβολές στη ρύθμιση της κυτταρικής μετανάστευσης τουοστεοσαρκώματος. Λαμβάνοντας υπόψην τη σημασία του TGFβ στα οστά καθώς καιτην ρυθμιστική επίδραση που έχει η διγλυκάνη σε αυτόν και προκειμένου ναδιαπιστωθεί η αναγκαιότητα του TGFβ για τη μετανάστευση των κυττάρων τουοστεοσαρκώματος δημιουργήθηκαν κύτταρα MG63 ελλιπή σε διγλυκάνη στα οποίαπροστέθηκε αντίσωμα έναντι του TGFβ. Διαπιστώθηκε ότι ενώ τα κύτταρα που ήτανελλιπή σε διγλυκάνη παρουσίασαν αύξηση της μεταναστευτικής δραστηριότηταςτους (Ρ<0.01), τα ελλιπή σε διγλυκάνη κύτταρα στα οποία είχε επίσης προστεθεί τοαντίσωμα anti-TGFβ1 δεν κατόρθωσαν να αυξήσουν την μεταναστευτικήδραστηριότητά τους γεγονός που καταδυκνύει την σημασία του TGFβ1 στηνμεταναστευτική ικανότητα τους. Λαμβάνοντας υπόψην την σημασία που έχει ησυνδεκάνη 4 στην βιολογία διαφορετικών καρκινικών κυττάρων καθώς και τηνσημασία του συμπλόκου FGFR/συνδεκάνη 4 στην επίτευξη αυτού του ρόλουθελήσαμε να διαπιστώσουμε την σημασία της συνδεκάνη 4 στην μετανάστευση τωνκυττάρων οστεοσαρκώματος ΜG63. Έτσι προχωρήσαμε στην δημιουργία κυττάρωνMG63 ανεπαρκών σε συνδεκάνη 4 (siSynd4) στα οποία χορηγήσαμε FGF2 καιδιαπιστώσαμε οτι αυτά δεν παρουσίασαν την αναμενόμενη αύξηση στην ικανότητατους να μεταναστεύουν.Κατα αυτόν τον τρόπο δείξαμε οτι η συνδεκάνη 4 αποτελείένα απαραίτητο μόριο στο μηχανισμό με τον οποίο ο FGF-2 επιτυγχάνει την αύξησητης κυτταρικής μετανάστευσης των MG63 κυττάρων.Συμπεράσματα: Mε την παρούσα μελέτη διαπιστώθηκαν 2 πιθανοί μηχανισμοίδιαμέσου των οποίων η ΡΤΗ (1-34) επιτυγχάνει τη δράση της στη μεταναστευτικήικανότητα των κυττάρων του οστεοσαρκώματος. 1ος Μηχανισμος: Η ΡΤΗ (1-34) ελέγχοντας τον μεταβολισμό του υαλουρονικούοξέος (ΗΑ) αυξάνει τη μεταναστευτική ικανότητα των κυττάρων τουοστεοσαρκώματος.2ος Μηχανισμός: Η ΡΤΗ (1-34) ελέγχοντας την σύνθεση της διγλυκάνης με τηδιαμεσολάβηση του FGF-2 κατορθώνει να μεταβάλλει τη μεταναστευτική ικανότητατων κυττάρων του οστεοσαρκώματος. Σε αυτή τη δράση του FGF-2 κρίσιμο ρόλοέχει η συνδεκάνη 4.