Βιολογική δράση του καρβοξαμιδικού μυκητοκτόνου fluopyram και χαρακτηρισμός ανθεκτικών στελεχών του φυτοπαθογόνου μύκητα Botrytis cinerea

Abstract

Grey mould is caused by the fungus Botrytis cinerea Pers: Fr., theanamorph of the ascomycete fungus Botryotinia fuckeliana (de Bary) Whetzel,is a cosmopolitan fungus attacking more than 200 plant species in the temperatezone worldwide. The control of the disease, is based on the integrationof several cultural methods with the use of fungicides belonging to severalgroups. However, B. cinerea represents a classical ‘high risk’ pathogen in viewof resistance development, and, in the past, some of the most serious problemsof fungicide resistance development have been encountered with this pathogen.Consequently, new compounds with novel modes of action have to beintroduced into the spray programmes to retain effective control of grey mould.The SDHi group of fungicides is divided into seven different chemical classes,including 15 different molecules. They all share a common mode of action,consisting of the inhibition of complex ii in the mitochondrial respiratorychain, also known as succinate : quinone oxidoreductase (SQR) or succinatedehydrogenase (SDH). The enzyme plays a crucial role in the tricarboxyliccycle and the mitochondrial electron transport chain, and its inhibition leadsto a block of the cell energy cycle.Fluopyram is a new broad-spectrum fungicide belonging to the subgroupof pyridinyl ethylbenzamides, a chemical group within the class of SDHis. itis biologically active against all the stages of fungal growth, from spore germinationto spore production. Fluopyram has not been delivered to the marketyet, and information relating to its activity against B. cinerea or the baselinesensitivity of the pathogen is limited.The current investigation was conducted in order: a) to study the biologicalactivity of fluopyram against B. cinerea and to obtain the fungal baselinesensitivity, b) to develop a molecular method that enables the rapid detectionand characterization of the resistant strains, c) to determine the differentialeffects of the sdhB gene mutations of the resistant strains of B. cinerea on thesensitivity to SDHi fungicides and d) to measure different fitness parametersin order to predict the involvement of possible fitness costs in the evolutionand development of resistance.in total 192 single- spore isolates of B. cinerea, from diseased fruits ofdifferent crops and sites that have not been treated with any SDHi fungicide,from several regions of Greece during 2008, has been collected. The resultsshown that the inhibition of germ tube elongation was found to be the mostsensitive growth stage affected by fluopyram, while mycelial growth was foundto be the least sensitive growth stage. Fluopyram provided excellent protectiveactivity against B. cinerea of the strawberry fruit. Similarly, fluopyram showeda high curative activity when it was applied at 100 μg mL−1 24h post-inoculation,but when applications were conducted 48 or 96 h post-inoculation, diseasecontrol efficacy was modest or low. The measurement of baseline sensitivityshowed that it was unimodal in all the populations tested. The individual EC50values for fluopyram ranged from 0.03 to 0.29 μg mL−1. in addition, no correlationwas found between sensitivity to fluopyram and sensitivity to otherfungicides of different chemical gropups, including cyprodinil, fenhexamid,fludioxonil, iprodione, and pyraclostrobin.Based on the fact that strawberry fields in Greece are heavily treatedwith fungicides, during a 3-year period (2008–10), 122 single spore isolates ofBotrytis cinerea were collected from strawberry fields located in northernGreece and tested for their sensitivity to boscalid. Sensitivity measurementsshowed three distinct phenotypes consisting of isolates highly sensitive (fungicideconcentration causing inhibition of germ tube growth by 50% [EC50 values]of 0.05 to 0.21 μg ml–1), moderately resistant (EC50 values of 1.37 to 7.79μg ml–1), or highly resistant (EC50 values of >50 μg ml–1) to boscalid.Sequence analysis of the sdhB gene revealed five different mutationsleading to amino acid substitutions in the SdhB subunit in isolates moderatelyresistant and highly resistant to boscalid. Three moderately resistant isolatesshowed a nucleotide change from A to T at codon 230, resulting in an asparagineto isoleucine (N230i) substitution. Several moderately resistant isolatesshowed a nucleotide change from C to T at codon 272, resulting in a substitutionfrom histidine to arginine (H272R) whereas, in another set of isolates,a nucleotide change from A to G was found at the same codon, leading to asubstitution from histidine to tyrosine (H272Y). One highly resistant isolatehad a nucleotide change from A to T at codon 272, leading to a substitutionfrom histidine to leucine (H272L), whereas in three other highly resistant isolates,a double nucleotide change from CC to TT was observed at codon 225,resulting in a substitution from proline to phenylalanine (P225F). To facilitate rapid detection of these mutations associated with resistanceto fluopyram, a primer-introduced restriction analysis polymerase chain reaction(PiRA-PCR) was developed. The method was successfully applied tothe moderately and highly resistant subpopulations and showed that the H272Rmutation was predominant with relative frequencies of 28.5, 37.5, and 30%during 2008, 2009, and 2010, respectively. in contrast, the H272L mutationwas detected at a frequency of 2.5% only in the 2009 population, whereas theP225F mutation was detected at a frequency of 7.5% only in the 2010 population.Despite the common mode of action of SDHi fungicides, there is strongevidence that these fungicides have different efficacy against resistant strainsof several pathogens. Based on the fact that SDHis constitute a fungicidegroup with an increasing importance for the control of significant plant diseases,the cross-resistance relationships within several SDHi fungicides amongB. cinerea isolates possessing different Sdh mutations and the assessement ofthe impact of each mutation on the efficacy of boscalid or fluopyram in in vivoassays, has been investigated. The results showed different sensitivities andcross-resistance patterns between structurally different SDHis. P225F mutantswere resistant in vitro to all SDHis tested. Similarly, isolates possessing the H272L mutation were highly resistant to boscalid but showed low to moderatelevels of resistance to other SDHis. The N230i mutants were moderately resistantto boscalid, fluopyram, and fluxapyroxad and showed low resistancelevels to isopyrazam, bixafen, fenfuram, benodanil, and carboxin. The H272Rmutants showed moderate levels of resistance to boscalid and low resistancelevels to isopyrazam, fenfuram, and carboxin but remained sensitive to fluopyram,bixafen, fluxapyroxad, and benodanil. Similarly, the H272Y showedmoderate levels of resistance to boscalid and very low resistance levels to isopyrazam,bixafen, fenfuram, and carboxin but showed increased sensitivity tobenodanil and fluopyram. Boscalid provided moderate to high control in caseof infestation by H272R/Y and N230i mutants in detached fruit assays butprovided little control when H272L and P225F mutants were used. in contrast,fluopyram was effective in case of infestation by H272R/Y mutants and providedmoderate levels of control when H272L, N230i, and P225F mutantswere used. Our findings suggest that sensitivity to SDHis may vary greatly,dependent on the point mutation in the sdhb subunit.Concerning the measurement of different fitness parameters, all the isolatesof B. cinerea with sdhB mutions possessing also the G143A mutation inthe cytb. Ten of the tested isolates were of wild-type sensitivity to any fungicide and not possessing any mutation in sdh or cytb, ten of them were singly resistantto Qois and were possessing the G143A substitution, while the remaining werepossessing the sdhB H272R, H272Y, H272L, P225F, N230i and the cytb G143Amutations (10, 10, 6, 9, and 10 isolates, respectively). The results shown thatthe mycelial growth, similar to that of the wild-type isolates was found onlyfor the H272R isolates at 7oC and the H272L isolates at 20oC. At the lowertemperature tested of 7 oC the lower mycelial growth was observed in P225Fand H272L isolates. At the optimal temperature of 20oC the lower mycelialgrowth was observed in H272Y isolates and at the temperature of 30oC thelower mycelial growth was observed in H272Y, H272L and P225F isolates.Conidial germinability was severely affected by the lower incubation temperatureof 7oC, while no differences were observed in conidial germinabilityat 20 and 30oC. in all the incubation temperatures the higher absolute valuesof conidial germinability were observed in isolates of wild-type sensitivity.isolates possessing the H272L mutation produced significantly (P<0.05)more sclerotia than the other groups of isolates under both incubation temperatures.Relatively a higher number of sclerotia was also produced by theH272R isolates. The lower number of sclerotia in both incubation temperatureswas produced by the wild-type isolates, the isolates with single resistance to Qois and the H272Y and P225F mutants. Significant reduction was observedin the viability of sclerotia stored at 37oC after 2 months of storage. The higherviability was observed in the sclerotia of the wild-type and the G143A isolates,while sclerotia of the H272L isolates lost totally their viability.Aggressiveness values for the H272R isolates were similar (P<0.05) tothe respective values for the wild-type isolates at 20 and 27oC, while they werehigher (P>0.05) than that of the wild-type isolates at 7oC. in all the 3 temperaturestested the H272L and P225F isolates showed lower lesion diameter valuescompared to the lesion diameters caused by the wild type isolates or theH272R/Y and the N230i isolates. The higher sporulation capacity was observedin the wild-type and the H272R isolates. in contrast, H272L and P225F isolatesshowed the lower (P<0.05) spore production capacity.The results of this study showed that the isolates possessing the sdhB mutationswere more sensitive to oxidation stress imposed by diquat amendmentin the growth medium, compared to wild-type isolates or the isolates withsingle resistance to Qois. The observed sensitivity of sdhB mutants to oxidationstress may explain the lower mycelial growth and the lower pathogenicity reportedin individual fitness components measurements.The findings of this study suggest that introduction into the spray pro-grams of newer SDHi fungicides such as fluopyram may lead to changes inthe type of mutations associated with resistance to SDHis dominating in thefungal population.The observed fitness penalty in isolates of B. cinerea with double resistanceto SDHis and Qois, associated with different mutations in sdhB and the cytbG143A, reported in the current study, may have important implications to thedisease management. Anti-resistance strategies should aim to slow down resistancefrequencies by decreasing the rate of the resistance alleles using fungicidesbelonging to different chemical classes. Applications of them in alternationschemes with SDHis could contribute to a decrease in the SDHis/Qoisresistance frequency. Furthermore, newer SDHi molecules could contributeto the elimination of already selected strains possessing sdhB mutations suchas H272R or H272Y. However, alternation of SDHis cannot be recommendedin the agricultural practice since this may lead to changes in the mutation-typefrequency and the development of populations with higher levels of resistanceto SDHis.

O μύκητας Botrytis cinerea (τέλεια μορφή Botryotinia fuckeliana (de Bary)Whetzel) προσβάλλει περισσότερα από 200 διαφορετικά φυτικά είδη σε όλοτον κόσμο. Η αντιμετώπιση της ασθένειας που προκαλεί στηρίζεται στην συν-δυασμένη χρήση πολλών καλλιεργητικών μέτρων καθώς και στη χρήση μυ-κητοκτόνων από διαφορετικές χημικές ομάδες.Παρόλα αυτά, ο B. cinerea,θεωρείται παθογόνο υψηλού κινδύνου για την ανάπτυξη της ανθεκτικότηταςκαι κατά το παρελθόν έχουν προκύψει πολύ σημαντικά προβλήματα ανθε-κτικότητας σε πολλές χημικές ομάδες μυκητοκτόνων.Επομένως, η εισαγωγή στα προγράμματα ψεκασμών μυκητοκτόνων μεδιαφορετικό (νέο) μηχανισμό δράσης είναι απαραίτητη προκειμένου να δια-τηρηθεί υψηλή η αποτελεσματικότητα καταπολέμησης της ασθένειας. Η χη-μική ομάδα των καρβοξαμιδικών μυκητοκτόνων χωρίζεται σε επτά υποομάδεςοι οποίες συνολικά αποτελούνται από 15 διαφορετικά μόρια. Όλα τα μυκη-τοκτόνα της ομάδας έχουν κοινό τρόπο δράσης, που συνίσταται στην παρε-μπόδιση του ενζύμου αφυδρογονάση του ηλεκτρικού οξέος (σύμπλοκο ΙΙ τηςαναπνοής). Το ένζυμο συμμετέχει στον κύκλο του τρικαρβοξυλικού οξέοςκαι στην μιτοχονδριακή αλυσίδα μεταφοράς των ηλεκτρονίων και η παρε-μπόδισή του οδηγεί στη διακοπή εφοδιασμού των κυττάρων με ενέργεια. Το fluopyram, είναι ένα μυκητοκτόνο με ευρύ φάσμα δράσης. Η βιολο-γική του δράση εκδηλώνεται σε όλα τα στάδια ανάπτυξης του μύκητα από τημόλυνση ως τη βλάστηση των σπορίων.Η παρούσα εργασία έγινε με σκοπό: α) να μελετηθεί η βιολογική δράσητου fluopyram εναντίον του B. cinerea και να μετρηθεί η ευαισθησία άγριωνπληθυσμών, β) να χαρακτηριστούν μοριακά τα ανθεκτικά στελέχη και νααναπτυχθεί μοριακή μέθοδος με σκοπό τη γρήγορη ανίχνευση των ανθεκτικώνστελεχών, γ) να διερευνηθούν οι σχέσεις διασταυρωτής ανθεκτικότητας με-ταξύ των μελών της ομάδας των SDHis (Succinate Dexydrogenase inhibitors)και δ) να μετρηθούν διάφορες παράμετροι προσαρμοστικότητας με σκοπό να αξιολογηθεί η ενδεχόμενη επίδραση του κόστους προσαρμοστικότηταςστην ανάπτυξη και εξέλιξη της ανθεκτικότητας.Συνολικά, συλλέχθηκαν 192 μονόσπορες απομονώσεις από διαφορετικέςπεριοχές της Ελλάδας και από διαφορετικές καλλιέργειες, από αγρούς πουδεν είχαν δεχθεί καμμιά εφαρμογή με SDHi μυκητοκτόνα. Τα αποτελέσματαέδειξαν πως το πιο ευαίσθητο στο fluopyram στάδιο ανάπτυξης του μύκηταήταν η επιμήκυνση του βλαστικού σωλήνα των κονιδίων. Το fluopyram έδειξεεξαιρετική προστατευτική δράση σε καρπούς φράουλας που μολύνθηκαν τε-χνητά 96, 48 και 24 ώρες πριν τη μόλυνση και πολύ καλή θεραπευτική δράσηόταν εφαρμόσθηκε 24 ώρες μετά τη μόλυνση. Σε όλους τους πληθυσμούς τουμύκητα που ελέγχθηκαν, η βασική γραμμή ευαισθησίας παρουσίαζε ένα μέ-γιστο και οι τιμές EC50 κυμάνθηκαν από 0.03 ως 0.29 μg ml-1. Επιπλέον, δενδιαπιστώθηκε σχέση διασταυρωτής ανθεκτικότητας μεταξύ του fluopyramκαι χημικών ομάδων μυκητοκτόνων όπως του cyprodinil, fludioxonil, fenhexamid,iprodione και pyraclostrobin.Κατά την περίοδο 2008-2010, απομονώθηκαν από διαφορετικούς αγρούςφράουλας της Β. Ελλάδας, 122 μονόσπορες απομονώσεις του B. cinerea καιελέγχθηκε η ευαισθησία τους στο boscalid. Oι μετρήσεις, έδειξαν την παρου-σία τριών ξεχωριστών φαινοτύπων που περιελάμβαναν απομονώσεις πολύ να αξιολογηθεί η ενδεχόμενη επίδραση του κόστους προσαρμοστικότηταςστην ανάπτυξη και εξέλιξη της ανθεκτικότητας.Συνολικά, συλλέχθηκαν 192 μονόσπορες απομονώσεις από διαφορετικέςπεριοχές της Ελλάδας και από διαφορετικές καλλιέργειες, από αγρούς πουδεν είχαν δεχθεί καμμιά εφαρμογή με SDHi μυκητοκτόνα. Τα αποτελέσματαέδειξαν πως το πιο ευαίσθητο στο fluopyram στάδιο ανάπτυξης του μύκηταήταν η επιμήκυνση του βλαστικού σωλήνα των κονιδίων. Το fluopyram έδειξεεξαιρετική προστατευτική δράση σε καρπούς φράουλας που μολύνθηκαν τε-χνητά 96, 48 και 24 ώρες πριν τη μόλυνση και πολύ καλή θεραπευτική δράσηόταν εφαρμόσθηκε 24 ώρες μετά τη μόλυνση. Σε όλους τους πληθυσμούς τουμύκητα που ελέγχθηκαν, η βασική γραμμή ευαισθησίας παρουσίαζε ένα μέ-γιστο και οι τιμές EC50 κυμάνθηκαν από 0.03 ως 0.29 μg ml-1. Επιπλέον, δενδιαπιστώθηκε σχέση διασταυρωτής ανθεκτικότητας μεταξύ του fluopyramκαι χημικών ομάδων μυκητοκτόνων όπως του cyprodinil, fludioxonil, fenhexamid,iprodione και pyraclostrobin.Κατά την περίοδο 2008-2010, απομονώθηκαν από διαφορετικούς αγρούςφράουλας της Β. Ελλάδας, 122 μονόσπορες απομονώσεις του B. cinerea καιελέγχθηκε η ευαισθησία τους στο boscalid. Oι μετρήσεις, έδειξαν την παρου-σία τριών ξεχωριστών φαινοτύπων που περιελάμβαναν απομονώσεις πολύ ευαίσθητες. Η αλληλούχιση του γονιδίου sdhB, αποκάλυψε πέντε διαφορε-τικές μεταλλαγές για τις απομονώσεις του B. cinerea με μέτρια και υψηλή αν-θεκτικότητα στο boscalid. Στις μέτρια ανθεκτικές απομονώσεις διαπιστώθηκεαντικατάσταση της ασπαραγίνης από ισολευκίνη στο κωδικόνιο 230 (N230i)ή αντικατάσταση της ιστιδίνης από αργινίνη ή τυροσίνη στο κωδικόνιο 272(H272/R/Y). Στις υψηλά ανθεκτικές απομονώσεις διαπιστώθηκε αντικατά-σταση της προλίνης από φαινυλαλανίνη στο κωδικόνιο 225 (P225F) ή αντι-κατάσταση της ιστιδίνης από λευκίνη στο κωδικόνιο 272 (H272L).Με σκοπό τη γρήγορη ανίχνευση των παραπάνω μεταλλαγών, αναπτύ-χθηκε η μέθοδος της PiRA-PCR. Η μέθοδος εφαρμόστηκε με επιτυχία στουςπληθυσμούς του B. cinerea με μέτρια και ισχυρή ανθεκτικότητα και έδειξεπως η μεταλλαγή H272R ήταν η κυρίαρχη με συχνότητες 28.5, 37.5 και 30%κατά τα έτη 2008, 2009 και 2010, αντίστοιχα. Αντίθετα, η μεταλλαγή H272L,ανιχνεύτηκε σε συχνότητα 2.5% μόνο στον πληθυσμό του 2009 και η μεταλ-λαγή P225F ανιχνεύτηκε σε συχνότητα 7.5% μόνο στον πληθυσμό του 2010.Παρά τον κοινό τρόπο δράσης μεταξύ των SDHis, υπάρχει ισχυρή έν-δειξη πως η αποτελεσματικότητα καταπολέμησης των ανθεκτικών στελεχών πολλών παθογόνων από το μυκητοκτόνα αυτά είναι διαφορετική. Δεδομένουότι η ομάδα των SDHis παρουσιάζει εξαιρετική σπουδαιότητα στη καταπο-λέμηση σημαντικών παθογόνων, διερευνήθηκαν οι σχέσεις διασταυρωτήςανθεκτικότητας μεταξύ πολλών SDHis σε απομονώσεις του μύκητα με δια-φορετικές μεταλλαγές στo sdhB και αξιολογήθηκε in vivo η επίδραση αυτώντων μεταλλαγών στην αποτελεσματικότητα καταπολέμησης της ασθένειαςμε το boscalid και το fluopyram. Τα αποτελέσματα έδειξαν πως υφίστανταιδιαφορετικά επίπεδα ευαισθησίας και διαφορετικές σχέσεις ανθεκτικότηταςμεταξύ των δομικά διαφορετικών SDHis. Τα στελέχη με την μεταλλαγή P225Fήταν ανθεκτικά σε όλα τα SDHi μυκητοκτόνα. Παρόμοια, οι απομονώσειςμε την μεταλλαγή H272L ήταν ισχυρά ανθεκτικές στο boscalid αλλά έδειξανμέτρια επίπεδα ανθεκτικότητας στα άλλα SDHis. Τα στελέχη με την μεταλ-λαγή N230i ήταν μέτρια ανθεκτικά στο boscalid, fluopyram και το fluxapyroxad,ενώ εμφάνιζαν χαμηλά επίπεδα ανθεκτικότητας στο isopyrazam, bixafen,fenfuram, benodanil και carboxin. Τα στελέχη με την μεταλλαγή H272Rείχαν μέτρια επίπεδα ανθεκτικότητας στο boscalid και χαμηλά επίπεδα αν-θεκτικότητας στο isopyrazam, fenfuram και carboxin, ενώ παρέμειναν ευαί-σθητα στο fluopyram, bixafen, fluxapyroxad και benodanil. Oμοίως, στελέχημε την μεταλλαγή H272Y έδειξαν μέτρια επίπεδα ανθεκτικότητας στο boscalidκαι πολύ χαμηλά στο isopyrazam, bixafen, fenfuram και carboxin, αλλά πα-ρουσίαζαν αυξημένη ευαισθησία στο fluopyram και το benodanil. In vivo, τοboscalid παρείχε μέτρια ως υψηλή καταπολέμηση της ασθένειας όταν αυτήπροκλήθηκε από στελέχη με τις H272R/Y και N230i μεταλλαγές, αλλά η απο-τελεσματικότητα καταπολέμησης ήταν χαμηλή όταν η ασθένεια προκλήθηκεαπό στελέχη με τις P225F και H272L μεταλλαγές. Αντίθετα, το fluopyramέλεγξε αποτελεσματικά τις H272R/Y μεταλλαγές, ενώ παρείχε μέτρια επί-πεδα καταπολέμησης των μεταλλαγών H272L, N230i και P225F.Όσον αφορά τις μετρήσεις διαφορετικών παραμέτρων προσαρμοστι-κότητας, όλες οι απομονώσεις του μύκητα που έφεραν μεταλλαγές στην sdhB,είχαν και την G143A μεταλλαγή στο cytb. Δέκα από τις απομονώσεις της με-λέτης ήταν άγριας ευαισθησίας σε κάθε μυκητοκτόνο και δεν έφεραν καμμιάμεταλλαγή στη sdhB ή στο cytb. Επιπλέον, δέκα είχαν απλή ανθεκτικότηταμόνο στους Qois αφού έφεραν την G143A μεταλλαγή στο cytb, ενώ οι υπό-λοιπες έφεραν στην sdhB τις μεταλλαγές H272R, H272Y, H272L, N230i καιP225F καθώς και την μεταλλαγή G143A στο cytb (10, 10, 6, 10 και 9 απομο-νώσεις, αντίστοιχα). Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι μυκηλιακή ανάπτυξη πα-ρόμοια με τις άγριας ευαισθησίας απομονώσεις, είχαν αυτές με την μεταλλαγήH272R στους 7°C και αυτές με την μεταλλαγή H272L στους 20°C. Στην χα-μηλότερη θερμοκρασία των 7°C τη μικρότερη μυκηλιακή ανάπτυξη είχαν οιαπομονώσεις με τις P225Fκαι H272L μεταλλαγές. Στην άριστη θερμοκρασία των 20°C, η μικρότερη μυκηλιακή ανάπτυξη παρατηρήθηκε στις H272Y απο-μονώσεις, ενώ στην υψηλή θερμοκρασία των 30°C η μικρότερη μυκηλιακήανάπτυξη παρατηρήθηκε στις απομονώσεις με τις μεταλλαγές H272Y, H272Lκαι P225F.Η βλαστικότητα των κονιδίων επηρεάστηκε ισχυρά στη χαμηλή θερμο-κρασία επώασης των 7°C, ενώ δεν παρατηρήθηκαν σημαντικές διαφορές στηβλαστικότητα στους 20 και 30°C. Σε όλες τις θερμοκρασίες επώασης οι με-γαλύτερες τιμές βλαστικότητας των κονιδίων αφορούσαν τα άγριας ευαισθη-σίας στελέχη του μύκητα.Oι απομονώσεις με την μεταλλαγή H272L παράγουν σημαντικά περισ-σότερα (P<0.05) σκληρώτια από ότι οι απομονώσεις των άλλων γενότυπων,σε όλες τις θερμοκρασίες επώασης. Σχετικά μεγάλος αριθμός σκληρωτίωνπαράγεται και από τις H272R απομονώσεις. Το μικρότερο αριθμό παραγό-μενων σκληρωτίων και στις δυο θερμοκρασίες επώασης, δίνουν οι απομο-νώσεις με άγρια ευαισθησία, καθώς και αυτές με την μεταλλαγή G143A, μετις μεταλλαγές H272Y και P225F. Σημαντική μείωση της βιωσιμότητας τωνσκληρωτίων παρατηρήθηκε όταν αυτά αποθηκεύτηκαν για 2 μήνες στους37°C. Η μεγαλύτερη βιωσιμότητα παρατηρήθηκε στα άγριας ευαισθησίαςστελέχη καθώς και σε αυτά με την μεταλλαγή G143A, ενώ δεν υπήρξε καμιά βιωσιμότητα σκληρωτίων στα H272L στελέχη, τα οποία έχασαν πλήρως τηβιωσιμότητά τους.Oι τιμές μολυσματικότητας για τις H272R απομονώσεις ήταν παρόμοιες(P<0.05) με τις αντίστοιχες τιμές των άγριας ευαισθησίας στους 20 και 27°C,ενώ ήταν μεγαλύτερες (P>0.05) από αυτές της άγριας ευαισθησίας στους7°C. Στις τρεις θερμοκρασίες επώασης οι απομονώσεις με τις μεταλλαγέςH272L και P225F, εμφάνισαν μικρότερες τιμές διαμέτρου κηλίδας από αυτήπου προκλήθηκε από τις άγριας ευαισθησίας καθώς και με τις H272R/Y καιN230i απομονώσεις. Η υψηλότερη ικανότητα σποριοποίησης παρατηρήθηκεστις άγριας ευαισθησίας και στις H272R απομονώσεις. Αντίθετα, οι H272Lκαι P225F απομονώσεις εμφάνιζαν σημαντικά μικρότερη (P<0.05) ικανότητασποριοποίησης.Τα αποτελέσματα αυτής της μελέτης έδειξαν ότι οι απομονώσεις με τιςsdhB μεταλλαγές ήταν πιο ευαίσθητες στην οξειδωτική καταπόνηση που προ-κλήθηκε όταν στο υπόστρωμα ανάπτυξης προστέθηκε diquat, σε σύγκρισημε της άγριας ευαισθησίας ή με αυτές που έφεραν μόνο την μεταλλαγήG143A. Η ευαισθησία στην οξειδωτική καταπόνηση που παρατηρήθηκε στιςαπομονώσεις με sdhB μεταλλαγές ίσως εξηγεί την μικρή μυκηλιακή ανάπτυξηκαθώς και την μικρή μολυσματική ικανότητα που αναφέρθηκαν στις μετρήσεις των μεμονωμένων παραμέτρων προσαρμοστικότητας. Τα ευρήματα αυτήςτης μελέτης αποδεικνύουν ότι η εισαγωγή στα προγράμματα ψεκασμών νέωνSDHi μυκητοκτόνων όπως το fluopyram ίσως οδηγήσουν σε αλλαγές στο εί-δος των μεταλλαγών που σχετίζονται με τη ανθεκτικότητα στους SDHis καιείναι κυρίαρχες στο πληθυσμό του παθογόνου.