Η δραστικότητα της πενταμιδίνης έναντι του υφομύκητα fusarium in vitro και in vivo σε πειραματικό μοντέλο ποντικού με διηθητική πνευμονική φουσαρίωση

Abstract

Background:Fusariosis is an opportunistic mycosis that has emerged as a significant cause of morbidity and mortality in immunosuppressed patients with hematological malignancies and recipients of bone marrow transplantation. Currently used antifungal agents have limited activity against Fusarium species accounting for the exceedingly high mortality of this mycosis. Methods:In the present work, we first investigated the in vitro activities of pentamidine (PNT) against 10 clinical isolates of Fusarium species (five Fusarium solani isolates and five non-Fusarium solani isolates) by using the NCCLS microdilution method in three different media (RPMI, RPMI-2, YNB), disk diffusion susceptibility testing, and viability dye staining. We also tested the in vitro interaction of PNT and amphotericin B (AMB), the current mainstay of treatment of fusariosis in clinical practice. We then investigated the in vivo activity of PNT, as prophylaxis or early treatment in a murine model of acute invasive pulmonary fusariosis. Balb-c mice were rendered neutropenic by intraperitoneal (IP) cyclophosphamide and 96 hours later were infected intranasally with conidia of a Fusarium oxysporum isolate, followed by IP cyclophosphamide 24 hours post-infection. Groups of 10 mice each were given: (1) PNT prophylaxis (8.5 mg/kg/day intravenously [IV] starting 24 hours prior to infection), or (2) PNT treatment (8.5 mg/kg/day IV starting 6 hours post-infection), or (3) AMB prophylaxis (1.5 mg/kg/day IP starting 24 hours prior to infection), or (4) IV saline (control). Survival was assessed until 96 hours post-infection when surviving mice were euthanized. Lungs from euthanized mice were harvested for quantification of tissue fungal burden by qPCR and histopathology analysis. Results:PNT had significant in vitro activities against all 10 Fusarium isolates. Non-Fusarium solani isolates were more susceptible than Fusarium solani isolates (P < 0.05). Additionally, PNT was fungicidal against all non-Fusarium solani isolates, whereas it had fungistatic effects against four of the five Fusarium solani isolates. PNT also exhibited greater activity against conidial than against hyphal developmental program of growth of the fungus. This fungicidal activity against non-Fusarium solani isolates was confirmed microscopically after staining of PNT-treated Fusarium oxysporum hyphae with the fluorescent viability dyes 5,(6)-carboxyfluorescein diacetate (CFDA) and bis-(1,3-dibutylbarbituric acid) trimethine oxonol (DiBAC). The MICs at which 50% of the isolates were inhibited (MIC50: 2 μg/ml for non-F. solani isolates and 4 μg/ml for Fusarium solani isolates) and the minimum fungicidal concentration at which 50% of the isolates were killed (MFC50: 8 μg/ml for non-Fusarium solani isolates) were much lower than the PNT tissue concentrations previously reported in humans using conventional daily intravenous PNT dosing (4 mg/Kg/day). In addition, PNT was more active against Fusarium isolates in a hypoxic environment of in vitro growth (P < 0.05). This finding may be clinically significant, because Fusarium, an angiotropic mold, causes tissue infarcts with resultant low tissue perfusion. Also, PNT and AMB were synergistic against the majority of tested Fusarium isolates, mainly by using the checkerboard method but also, to a lesser extent by using the disk diffusion susceptibility testing method. In the in vivo part of this work, it was found that intranasal inoculation of mice with ~ 70 x 105 conidia of a Fusarium oxysporum clinical isolate (35 l from a 2 x 108 conidia/ml solution) resulted in an acute necrotizing pneumonia with reproducible mortality of 90 – 100% 96 hours post-infection. Mice given PNT prophylaxis had significant better survival 96 hours post-infection (77%) compared to control mice (10%; P = 0.003) or mice given AMB prophylaxis (33%; P = 0.01). PNT-treated mice had better survival (30%) than untreated controls (10%; P = 0.01). The tissue fungal burden of mice given PNT prophylaxis was significantly lower compared to control mice or mice given AMB prophylaxis by both histopathology and qPCR analysis. Conclusions:PNT had significant in vitro activity against all tested Fusarium clinical isolates and had synergistic effects with AMB against the majority of the tested isolates. In addition, PNT given as prophylaxis or early treatment had substantial in vivo activity in a neutropenic murine model of acute invasive pulmonary fusariosis. These findings suggest that clinical studies are warranted to explore the potential of PNT in the management of human invasive fusariosis.

Εισαγωγή:Από τις αρχές της δεκαετίας του 1990, η διηθητική φουσαρίωση έχει εξελιχθεί σε μια σημαντική αιτία νοσηρότητας και θνητότητας σε ασθενείς με σημαντικού βαθμού ανοσοκαταστολή όπως είναι ασθενείς με αιματολογικές νεοπλασίες και αποδέκτες αλλογενούς μεταμόσχευσης του μυελού των οστών. Τα χρησιμοποιούμενα αντιμυκητιασικά φάρμακα έχουν μικρή δραστικότητα έναντι του υφομύκητα Fusarium με αποτέλεσμα την πολύ υψηλή θνητότητα της ευκαιριακής αυτής λοίμωξης.Μέθοδοι:Στην παρούσα διδακτορική διατριβή, μελετήθηκε η in vitro δραστικότητα της πενταμιδίνης έναντι 10 κλινικών στελεχών Fusarium (5 στελέχη Fusarium solani και 5 non-Fusarium solani στελέχη) χρησιμοποιώντας διάφορες μικροβιολογικές τεχνικές (NCCLS M-38P, disk diffusion susceptibility testing, χρήση φθορίζουσων χρωστικών CFDA και DiBAC) σε διαφορετικά μέσα καλλιέργειας (RPMI, RPMI-2, YNB) και υπό διαφορετικές συνθήκες οξυγόνου (αερόβιες, μικροαεροφιλικές, αναερόβιες). Επίσης, μελετήθηκε η in vitro αλληλεπίδραση της πενταμιδίνης με την αμφοτερικίνη Β έναντι των στελεχών Fusarium με τη χρήση των μεθόδων checkerboard και disk diffusion susceptibility testing. Στη συνέχεια έγινε μελέτη της in vivo δραστικότητας της πενταμιδίνης έναντι του υφομύκητα Fusarium ως προφύλαξη ή θεραπεία σε ένα πειραματικό μοντέλο ποντικού με οξεία διηθητική πνευμονική φουσαρίωση. Συγκεκριμένα, σε Balb-c ποντίκια προκλήθηκε ουδετεροπενία με χορήγηση ενδοπεριτοναϊκής (IP) κυκλοφωσφαμίδης και 96 ώρες αργότερα τα ποντίκια μολύνθηκαν μέσω της ενδορινικής/αναπνευστικής οδού με κονίδια ενός κλινικού στελέχους Fusarium oxysporum, ακολουθούμενο από μια ακόμα ΙP ένεση κυκλοφωσφαμίδης 24 ώρες αργότερα. Διαφορετικές ομάδες ποντικών (10 σε κάθε ομάδα) έλαβαν: (α) προφύλαξη με πενταμιδίνη (8.5 mg/kg/24 ώρες ενδοφλέβια [IV] ξεκινώντας 24 ώρες πριν την εγκατάσταση της λοίμωξης), ή (β) θεραπεία με πενταμιδίνη (8.5 mg/kg/24 ώρες IV ξεκινώντας 6 ώρες μετά την εγκατάσταση της λοίμωξης), ή (γ) προφύλαξη με αμφοτερικίνη Β (1.5 mg/kg/24 ώρες IP ξεκινώντας 24 ώρες πριν την εγκατάσταση της λοίμωξης), ή (δ) φυσιολογικό ορό (μάρτυρας). Η επιβίωση των ποντικών καταγράφηκε κάθε 12 ώρες μέχρι 96 ώρες μετά την εγκατάσταση της λοίμωξης οπότε τα εναπομείναντα ζωντανά ποντίκια θανατώθηκαν με ευθανασία. Οι πνεύμονες των ποντικών συλλέγθηκαν με σκοπό την ποσοτικοποίηση του εύρους της πνευμονικής διήθησης από τον υφομύκητα Fusarium με βάση την ποσοτική αντίδραση αλυσιδωτής πολυμεράσης (qPCR) όπως επίσης και για την ποιοτική ανάλυση της πνευμονικής διήθησης με τη χρήση ιστοπαθολογίας. Αποτελέσματα:Η πενταμιδίνη είχε in vitro δραστικότητα έναντι και των 10 κλινικών στελεχών Fusarium. Τα στελέχη non-Fusarium solani ήταν πιο ευαισθητα στην πενταμιδίνη από ότι τα αντίστοιχα στελέχη Fusarium solani (P < 0.05). Επιπλέον, η πενταμιδίνη είχε μυκητοκτόνο δράση έναντι των non-Fusarium solani στελεχών, ενώ ήταν μυκητοστατική έναντι 4 εκ των 5 στελεχών Fusarium solani. Η πενταμιδίνη είχε μεγαλύτερη δραστικότητα έναντι των κονιδίων του υφομύκητα σε σχέση με τη δραστικότητα της έναντι των υφών Fusarium. Η μυκητοκτόνος δράση της πενταμιδίνης έναντι των στελεχών non-Fusarium solani επιβεβαιώθηκε εν συνεχεία μικροσκοπικά με χρώση υφών Fusarium oxysporum οι οποίες είχαν εκτεθεί προηγουμένως σε πενταμιδίνη με τις φθορίζουσες χρώσεις 5,(6)-carboxyfluorescein diacetate (CFDA) και bis-(1,3-dibutylbarbituric acid) trimethine oxonol (DiBAC). Οι τιμές ελάχιστης ανασταλτικής συγκέντρωσης της πενταμιδίνης στις οποίες το 50% των στελεχών είχαν αναστολή της ανάπτυξης τους (MIC50: 2 μg/ml για τα στελέχη non-Fusarium solani και 4 μg/ml για τα στελέχη Fusarium solani) όπως και η τιμή της ελάχιστης μυκητοκτόνου συγκέντρωσης της πενταμιδίνης στην οποία το 50% των στελεχών θανατώθηκαν (MFC50: 8 μg/ml για τα στελέχη non-Fusarium solani) ήταν κατά πολύ μικρότερες από τις συγκεντρώσεις της πενταμιδίνης οι οποίες μπορούν να επιτευχθούν στους ιστούς ασθενών οι οποίοι λαμβάνουν συνήθεις δόσεις ενδοφλέβιας πενταμιδίνης (4 mg/kg/ημέρα) στην κλινική πράξη. Επιπλέον, η πενταμιδίνη ήταν πιο δραστική έναντι των στελεχών Fusarium σε ένα in vitro περιβάλλον με συνθήκες χαμηλής τάσης οξυγόνου (Ρ < 0.05). Το συγκεκριμένο εύρημα είναι πιθανό να έχει κλινική σημασία καθώς ο υφομύκητας Fusarium έχει αγγειοτρόπες ιδιότητες με αποτέλεσμα να προκαλεί ιστικά έμφρακτα και χαμηλή ιστική αιμάτωση. Επιπρόσθετα, η πενταμιδίνη και η αμφοτερικίνη Β είχαν συνεργική αλληλεπίδραση έναντι της πλειοψηφίας των στελεχών Fusarium κυρίως με τη μέθοδο checkrboard αλλά και σε μικρότερο βαθμό και με τη μέθοδο disk diffusion susceptibility testing. Στο in vivo τμήμα των πειραμάτων της διδακτορικής διατριβής, βρέθηκε ότι ο ενδορινικός/αναπνευστικός ενοφθαλμισμός ποντικών Βalb-c με ~ 70 x 105 κονίδια Fusarium oxysporum (35 l από ένα διάλυμα με συγκέντρωση ίση με 2 x 108 κονιδίων/ml) οδήγησε σε οξεία νεκρωτική πνευμονία με θνητότητα 90 – 100% 96 ώρες μετά την εγκατάσταση της λοίμωξης. Ποντίκια που έλαβαν προφύλαξη με πενταμιδίνη είχαν πολύ καλύτερη επιβίωση 96 ώρες μετά την εγκατάσταση της λοίμωξης (77%) σε σχέση με τα ποντίκια που δεν έλαβαν καμία προφύλαξη (10%; P = 0.003) ή έλαβαν προφύλαξη με αμφοτερικίνη Β (33%; P = 0.01). Επιπλέον, τα ποντίκια που έλαβαν θεραπεία με πενταμιδίνη είχαν καλύτερη επιβίωση (33%) σε σχέση με τα ποντίκια που δεν έλαβαν καμία θεραπεία (33%; P = 0.01). Το εύρος της πνευμονικής διήθησης από τον υφομύκητα Fusarium στα ποντίκια που έλαβαν προφύλαξη με πενταμιδίνη ήταν σημαντικά μικρότερο σε σχέση με το αντίστοιχο εύρος διήθησης στα ποντίκια που δεν έλαβαν καμία προφύλαξη τόσο με βάση τη χρήση qPCR όσο και με βάση την ιστοπαθολογική ανάλυση.Συμπεράσματα:Η πενταμιδίνη είχε σημαντική in vitro δραστικότητα έναντι όλων των κλινικών στελεχών του υφομύκητα Fusarium που μελετήθηκαν στη παρούσα διδακτορική μελέτη και είχε συνεργική αλληλεπίδραση με την αμφοτερικίνη Β έναντι των περισσότερων κλινικών στελεχών Fusarium. Επιπλέον, η πενταμιδίνη, τόσο ως προφύλαξη όσο και ως θεραπεία, είχε σημαντική in vivo δραστικότητα σε ένα πειραματικό μοντέλο ποντικού Balb-c με οξεία διηθητική πνευμονική φουσαρίωση. Τα επιστημονικά αύτα ευρήματα υποστηρίζουν την ανάγκη διενέργειας κλινικών μελετών για τη διερεύνηση της αποτελεσματικότητας της χρήσης πενταμιδίνης σε περιπτώσεις διηθητικής φουσαρίωσης σε ασθενείς με τη θανατηφόρο αυτή λοίμωξη.