Μελέτη των συσσωματωμάτων αιμοπεταλίων - μονοκυττάρων στην ιδιοπαθή αρτηριακή υπέρταση

Abstract

Essential hypertension (EH) is associated with an increased incidence of arterial thrombotic complications, which is sustained by a number of factors: endothelial dysfunction, clinically detectable atherosclerosis, increased activity of the sympathetic nervous system and the renin-angiotensin-aldosterone system (RAAS), changes in coagulation and fibrinolysis and increased platelet activation. When platelets are activated, they aggregate with each other and with monocytes forming monocyte–platelet aggregates (MPA). Circulating MPA levels represent the most sensitive and robust marker in several clinical settings. The objective of this study was to investigate the presence of ιIncreased thrombotic tendency and factors associating with it from the early stages of EH.Therefore, we enrolled newly diagnosed and untreated patients with EH and no comorbidities (UH) and healthy normotensive controls (NT). We utilized the exercise test (Bruce protocol) to model the effect of acute blood pressure (BP) rising after intense physical activity. MPA levels were studied by flow cytometry in both groups while resting and during acute exercise. Furthermore, we studied platelet P-selectin by flow cytometry and representative markers of coagulation and fibrinolysis, TAT (thrombin-antithrombin) complex and PAI-1 (plasminogen activator inhibitor-1) using ELISA kits. Changes of these markers were also studied after 3- month antihypertensive treatment. Then, we aimed to study the presence of subclinical atherosclerosis, endothelial dysfunction and arterial stiffness while resting and during acute exercise, when possible. Subclinical atherosclerosis was detected by carotid intima-media thickness (CIMT) using ultrasound measurements and endothelial dysfunction by asymmetric dimethylarginine (ADMA) using ELISA. Arterial stiffness was measured by aortic pulse wave velocity (aPWV) using applanation tonometry. High sensitivity C-reactive protein (hsCRP) and cardiotrophin-1 were also measured by ELISA.We studied 30 UH and 15 NT. No difference was found between the two groups in the demographic, clinical and biochemical characteristics, except for blood pressure (BP) levels. All participants achieved maximal high-intensity exercise in the exercise test. In total, 17 patients received antihypertensive treatment with an angiotensin receptor blocker (valsartan 160 mg) and were re-evaluated after 3 months. Treated patients achieved adequate BP control.Regarding MPA measurements, UH showed a significant increase of circulating MPA at peak exercise compared to baseline levels (p<0.001). MPA levels remained increased at 10 and 30 minutes after peak exercise (p<0.001 και p=0.002 respectively). On the contrary, NT showed a significant increase of MPA levels only 10 minutes after peak exercise (p=0.046). Between the two groups, MPA levels were significantly higher in UH subjects than NT subjects at maximal exercise and at 10 and 30 minutes of recovery (p=0.035, p=0.020 and p=0.016). Post-treatment MPA levels increased significantly only at 10 minutes into recovery (p=0.010) and were similar to those of NT subjects.In addition, we studied platelet P-selectin levels showing no significant difference between UH and NT at rest or during exercise. Post-exercise P-selectin levels were significantly increased in both groups compared to baseline levels. Post-treatment P-selectin levels were significantly decreased compared to pre-treatment levels.Along with platelet activation, we also investigated changes in coagulation and fibrinolysis by measuring TAT and PAI-1 levels. Significantly increased TAT and PAI-1 levels were found in UH versus NT at rest (p=0.018 and p=0.030 respectively), peak exercise (p=0.028 and p=0.024) and 30 minutes later (p=0.030 και p=0.042). UH showed an increase of TAT and PAI-1 levels at peak exercise (p=0.030 και p=0.036) compared to baseline levels; while NT exhibited a significant increase only of TAT complexes at peak exercise. Post-treatment levels of TAT and PAI-1 were significantly decreased compared to pre-treatment ones at rest, maximal exercise and 30 minutes later (p=0.008, p=0.019, p=0.028 and p=0.017, p=0.020, p=0.022 respectively).In participants with adequate measurements at all time-points, we also investigated arterial stiffness changes (n=25 and n=15 for UH and NT respectively). Aortic PWV was significantly increased in UH compared to NT at all time-points (p<0.001). In UH, we also found a significant increase of aPWV at peak exercise compared to baseline that was attenuated 10 and 30 minutes later. However, no significant change was observed in the NT group. Post-treatment aPWV values were significantly decreased at all time-points (p<0.001). During exercise, treated hypertensive individuals exhibited a significant increase of aPWV only at peak exercise.Then, we aimed to detect underlying functional and structural vascular changes in our naïve population. We observed a trend toward a significant increase of cardiotrophin-1 and ADMA levels in UH versus NT. To further investigate this trend we expanded our study population using the same inclusion and exclusion criteria. In total, we studied 45 UH and 25 NT. UH showed significantly increased CIMT compared to NT (0.62 ± 0.30 mm versus 0.49 ± 0.21 and 0.59 ± 0.2 mm versus 0.47 ± 0.08 for left and right common carotid artery respectively, p<0.001). However, there were no signs of subclinical atherosclerosis (CIMT<0.9 mm). Furthermore, we also detected a significant increase of hsCRP levels in UH compared to NT (2.8 ± 1.2 versus 0.24 ± 0.6 mg/l, p<0.001). In the multivariate analysis, central pulse pressure (β=0.309, p=0.007) and aPWV (β=0.385, p=0.001) proved independent predictors of hsCRP. In addition, cardiotrophin-1 levels were significantly increased: 542.03 ± 340.32 compared to 306.61 ± 187.5 pg/ml in NT (p<0.001). Central systolic and diastolic BP levels were found to independently correlate with cardiotrophin-1 levels in the multivariate analysis (β = 0.421; p = 0.04 και β=0.728; p=0.02), after correction for day systolic and diastolic BP, aPWV and hsCRP. Lastly, UH also exhibited increased ADMA levels (0.91 ± 0.3 in UH versus 0.53 ± 0.3 μmol/l in ΝΤ, p=0.039), which were significantly associated with systolic BP (r=0.276, p=0.042), aPWV (r=0.421, p=0.031) and hsCRP (r=0,582, p=0,039) levels. Of note, we observed a significant positive association between ADMA levels and maximal MPA levels at 10 minutes after peak exercise (r=0.324, p=0.047).In conclusion, young newly-diagnosed untreated patients with EH and no clinically detectable atherosclerosis showed an exaggerated and prolonged increase of platelet activation and hypercoagulability, along with impaired fibrinolysis after acute BP rising caused by acute high-intensity exercise. Similarly, untreated hypertensives exhibited an exaggerated and prolonged increase of arterial stiffness during acute exercise. In addition, 3-month antihypertensive treatment with valsartan resulted in a significant decrease of platelet activation and hypercoagulability and improvement of the fibrinolytic and arterial stiffness response back to levels similar to NT. Regarding underlying functional and structural vascular changes, hsCRP, cardiotrophin-1 and ADMA were significantly increased and correlated with arterial stiffness indices in hypertensive patients from the early stages of the disease.

Η ιδιοπαθής αρτηριακή υπέρταση χαρακτηρίζεται από αυξημένη συχνότητα θρομβωτικών επεισοδίων, για την οποία ενοχοποιείται πλειάδα παραγόντων: η ενδοθηλιακή δυσλειτουργία, η κλινικά ανιχνεύσιμη αθροσκλήρωση, η αυξημένη δραστηριότητα του συμπαθητικού νευρικού συστήματος (ΣΝΣ) και του συστήματος ρενίνης-αγγειοτενσίνης-αλδοστερόνης (ΣΡΑ), διαταραχές στο μηχανισμό πήξης και ινωδόλυσης και αυξημένη αιμοπεταλιακή ενεργοποίηση. Τα αιμοπετάλια όταν ενεργοποιούνται σχηματίζουν συσσωματώματα μεταξύ τους, αλλά και με τα μονοκύτταρα (monocyte–platelet aggregates/MPA). Τα επίπεδα κυκλοφορούντων MPA θεωρούνται ο πλέον ευαίσθητος και ακριβής δείκτης αιμοπεταλιακής ενεργοποίησης. Σκοπό της παρούσας μελέτης αποτέλεσε η διερεύνηση της θρομβωτικής τάσης και των παραγόντων που σχετίζονται με την εμφάνισή της από τα πρώιμα στάδια της ιδιοπαθούς αρτηριακής υπέρτασης. Για το σκοπό αυτό στην ομάδα των ασθενών επιλέχθηκαν νεοδιαγνωσθέντες ασθενείς με ΙΑΥ χωρίς συνοδά νοσήματα και χωρίς αγωγή (UH), ενώ η ομάδα των εθελοντών συνεστήθη από υγιείς νορμοτασικούς εθελοντές (NT). Η οξεία έντονη άσκηση (πρωτόκολλο Bruce) επιλέχθηκε ως μέσο οξείας αύξησης της αρτηριακής πίεσης. Τα επίπεδα MPA μελετήθηκαν με τη μέθοδο της κυτταρομετρίας ροής στις δύο ομάδες, τόσο σε ηρεμία όσο και μετά από οξεία έντονη άσκηση. Ακόμη, προς διερεύνηση της παθοφυσιολογίας των μεταβολών των MPA προσδιορίστηκαν στις ίδιες χρονικές στιγμές τα επίπεδα της αιμοπεταλιακής P-σελεκτίνης (P-selectin) με κυτταρομετρία ροής και αντιπροσωπευτικοί δείκτες πήξης και ινωδόλυσης (thrombin-antithrombin complex/ΤΑΤ και plasminogen activator inhibitor-1/PAI-1) με ανοσοενζυμική μέθοδο ELISA. Η μεταβολή των δεικτών επανεκτιμήθηκε μετά τη λήψη τρίμηνης αντιυπερτασικής αγωγής με ανταγωνιστή του ΣΡΑ. Ακολούθως, διερευνήθηκε η ύπαρξη πρώιμης αθηροσκλήρωσης, ενδοθηλιακής δυσλειτουργίας και αορτικής σκληρίας σε συνθήκες ηρεμίας και μετά από οξεία αύξηση αρτηριακής πίεσης για τους δείκτες που αυτό ήταν εφικτό. Για την ανίχνευση της πρώιμης αθηροσκλήρωσης μετρήθηκε το πάχος έσω-μέσου χιτώνα της κοινής καρωτίδας αρτηρίας (CIMT) με τη χρήση υπερήχων και της ενδοθηλιακής δυσλειτουργίας με τα επίπεδα ασσύμετρης διμεθυλαργινίνης (ADMA) ορού με ELISA. Η αορτική σκληρία εκτιμήθηκε με τη μετρηση της ταχύτητας του αορτικού σφυγμικού κύματος (PWV) χρησιμοποιώντας τη μέθοδο της τονομετρίας, ενώ ως δείκτες που επηρεάζουν την αορτική σκληρία μετρήθηκαν η υψηλής ευαισθησίας C-αντιδρώσα πρωτεΐνη (hsCRP) και η καρδιοτροφίνη-1 με ανοσοενζυμική μέθοδο ELISA.Μελετήθηκαν 30 UH και 15 NT χωρίς σημαντικές διαφορές στα δημογραφικά, κλινικά και βιοχημικά χαρακτηριστικά τους πέρα από τα επίπεδα της αρτηριακής πίεσης. Όλοι οι συμμετέχοντες ολοκληρωσαν τη δοκιμασία κόπωσης επιτυγχάνοντας επίπεδα οξείας έντονης άσκησης. Συνολικά, 17 ασθενείς έλαβαν αντιυπερτασική αγωγή με ανταγωνιστή των υποδοχέων της αγγειοτενσίνης-ΙΙ (βαλσαρτάνη 160 mg) και επανεκτιμήθηκαν μετά από την πάροδο τριών μηνών. Οι ασθενείς που έλαβαν αγωγή δεν παρουσίασαν στατιστικά σημαντική διαφορά ως προς τα βασικά χαρακτηριστικά σε σύγκριση με όσους δεν έλαβαν αγωγή. Στους ασθενείς υπό αγωγή επιτεύχθηκε ικανοποιητική ρύθμιση αρτηριακής πίεσης.Όσον αφορά στη μελέτη των κυκλοφορούντων MPA, οι υπερτασικοί ασθενείς χωρίς θεραπεία εμφάνισαν στατιστικά σημαντική αύξηση των επιπέδων MPA στη μέγιστη άσκηση (p<0,001), τα οποία παρέμειναν αυξημένα 10 και 30 λεπτά μετά τη μέγιστη άσκηση (p<0,001 και p=0,002 αντίστοιχα) σε σχέση με τα επίπεδα ηρεμίας. Αντίθετα, οι νορμοτασικοί παρουσίασαν σημαντική αύξηση των MPA μόνο μέχρι το τέλος της περιόδου αποκατάστασης (10 λεπτά μετά τη μέγιστη άσκηση, p=0,046). Μεταξύ των δύο ομάδων, οι υπερτασικοί ασθενείς παρουσίασαν στατιστικά σημαντικά υψηλότερα επίπεδα MPA τόσο κατά τη μέγιστη άσκηση, όσο και 10 και 30 λεπτά αργότερα (p=0,035, p=0,020 και p=0,016). Στους υπερτασικούς ασθενείς υπό αγωγή τα επίπεδα των MPA αυξήθηκαν σημαντικά μόνο 10 λεπτά μετά τη μέγιστη άσκηση σε σύγκριση με τα επίπεδα ηρεμίας (p=0,010) και βρέθηκαν συγκρίσιμα με τα επίπεδα των υγιών εθελοντών. Ακόμη, μελετήθηκαν και τα επίπεδα αιμοπεταλιακής P-σελεκτίνης, που δεν εμφάνισαν σημαντική διαφορά μεταξύ UH και ΝΤ. Μετά την οξεία έντονη άσκηση παρατηρήθηκε σημαντική αύξηση της P-σελεκτίνης σε σύγκριση με τα επίπεδα ηρεμίας και στις δύο ομάδες. Μετά την τρίμηνη αγωγή, οι υπερτασικοί ασθενείς υπό θεραπεία εμφάνισαν σημαντική μείωση της P-σελεκτίνης σε σύγκριση με τα επίπεδα προ αγωγής.Πριν και μετά την οξεία έντονη άσκηση προσδιορίστηκαν και οι δείκτες του συστήματος πήξης και ινωδόλυσης, ΤΑΤ και PAI-1. Σημαντικά αυξημένα επίπεδα ΤΑΤ και PAI-1 βρέθηκαν στους UH έναντι των ΝΤ σε ηρεμία (p=0,018 και p=0,030 αντίστοιχα), κατά τη μέγιστη άσκηση (p=0,028 και p=0,024) και 30 λεπτά αργότερα (p=0,030 και p=0,042). Κατά τη μέγιστη άσκηση οι υπερτασικοί ασθενείς εμφάνισαν σημαντική αύξηση τόσο των ΤΑΤ όσο και του PAI-1, σε σύγκριση με τα επίπεδα ηρεμίας (p=0,030 και p=0,036). Αντίθετα, στους νορμοτασικούς εθελοντές στατιστικά σημαντική αύξηση παρατηρήθηκε μόνο στο σύμπλεγμα ΤΑΤ και μόνο κατά τη μέγιστη άσκηση σε σύγκριση με τα επίπεδα ηρεμίας. Οι υπερτασικοί ασθενείς υπό αγωγή παρουσίασαν ακόμη στατιστικά σημαντική ελάττωση των επιπέδων ΤΑΤ και PAI-1 σε όλα τα χρονικά σημεία σε σύγκριση με τα επίπεδα προ αγωγής (p=0,008, p=0,019, p=0,028 και p=0,017, p=0,020, p=0,022 αντίστοιχα).Στους ασθενείς που έγιναν αξιόπιστες μετρήσεις σε όλες τις χρονικές στιγμές μετρήθηκε ακόμη η μεταβολή της αορτικής σκληρίας (n=25 και n=15 για UH και NT αντίστοιχα). Οι UH εμφάνισαν στατιστιστικά σημαντικά αυξημένη aPWV σε σύγκριση με τους NT σε όλες τις χρονικές στιγμές (p<0,001). Στους υπερτασικούς ασθενείς παρατηρήθηκε στατιστικά σημαντική αύξηση της aPWV κατά τη μέγιστη άσκηση, που διατηρήθηκε ακόμη και 10 και 30 λεπτά αργότερα. Αντίθετα, δε βρέθηκαν σημαντικές μεταβολές της aPWV στην ομάδα των υγιών εθελοντών. Μετά την τρίμηνη αντιυπερτασική αγωγή παρατηρήθηκε σημαντική μείωση της aPWV σε όλες τις χρονικές στιγμές (p<0,001). Κατά τη διάρκεια της άσκησης των ασθενών υπό αγωγή, σημαντικά αυξημένη βρέθηκε η aPWV μόνο κατά τη μέγιστη άσκηση.Κατά τη διερεύνηση των υποκείμενων λειτουργικών και δομικών αγγειακών διαταραχών στον ίδιο πληθυσμό, τάση προς στατιστικά σημαντική αύξηση βρέθηκε για τα επίπεδα της καρδιοτροφίνης-1 και της ADMA στους UH έναντι των ΝΤ. Για αυτό το λόγο διευρύνθηκε ο πληθυσμός μελέτης με βάση τα ίδια κριτήρια εισόδου και αποκλεισμού. Έτσι, μελετήθηκαν 45 UH και 25 NT. Οι υπερτασικοί ασθενείς εμφάνισαν αυξημένο CIMT σε σύγκριση με τους νορμοτασικούς (0,62 ± 0,30 mm έναντι 0,49 ± 0,21 και 0,59 ± 0,2 mm έναντι 0,47 ± 0,08 για την αριστερά και δεξιά κοινή καρωτίδα αντίστοιχα, p<0,001), χωρίς όμως σημεία υποκλινικής αθηροσκλήρωσης. Επιπλέον, βρέθηκε στατιστικά σημαντική αύξηση των επιπέδων hsCRP (2,8 ± 1,2 σε UH έναντι 0,24 ± 0,6 mg/l σε ΝΤ, p<0,001), που στην πολυπαραγοντική ανάλυση συσχετίστηκαν σημαντικά με την κεντρική πίεση παλμού (β=0,309, p=0,007) και την aPWV (β=0,385, p=0,001). Ακόμη, τα επίπεδα της καρδιοτροφίνης-1 βρέθηκαν σημαντικά αυξημένα (542,03 ± 340,32 pg/ml) στους UH έναντι 306,61 ± 187,5 στους ΝΤ (p<0,001). H κεντρική συστολική και διαστολική αρητριακή πίεση εμφάνισαν σημαντική και ανεξάρτητη συσχέτιση με τα επίπεδα της καρδιοτροφίνης-1 (β = 0,421; p = 0,04 και β=0,728; p=0,02), μετά από διόρθωση για τη συστολική και διαστολική αρτηριακή πίεση ημέρας, την aPWV και τη hsCRP. Tέλος, οι υπερτασικοί χωρίς θεραπεία εμφάνισαν σημαντικά αυξημένα επίπεδα ADMA (0,91 ± 0,3 σε UH έναντι 0,53 ± 0,3 μmol/l σε ΝΤ, p=0,039), που συσχετίστηκαν σημαντικά με τα επίπεδα της συστολικής αρτηριακής πίεσης ιατρείου (r=0,276, p=0,042), τα επίπεδα aPWV (r=0,421, p=0,031) και τα επίπεδα της hsCRP (r=0,582, p=0,039). Ακόμη, σημαντική συσχέτιση βρέθηκε και μεταξύ της ADMA και των μέγιστων επιπέδων MPA, που παρατηρήθηκαν 10 λεπτά μετά την οξεία έντονη άσκηση (r=0,324, p=0,047). Συμπερασματικά, νεαροί νεοδιαγνωσμένοι ασθενείς με ιδιοπαθή αρτηριακή υπέρταση χωρίς θεραπεία και χωρίς κλινικά ανιχνεύσιμη αθηροσκλήρωση εμφάνισαν παρατεταμένη και αυξημένη ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων και του συστήματος πήξης με συνοδό διαταραγμένη ινωδολυτική δραστηριότητα μετά από οξεία αύξηση της αρτηριακής πίεσης που προκλήθηκε μετά από οξεία έντονη άσκηση. Ακόμη, στους υπερτασικούς ασθενείς παρατηρήθηκε ταυτόχρονα σημαντική και παρατεταμένη επιδείνωση της αορτικής σκληρίας με την οξεία αύξηση της ΑΠ. Αντίθετα, στους υγιείς εθελοντές παρατηρήθηκε μειωμένης έντασης και διάρκειας ενεργοποίηση των αιμοπεταλίων και του συστήματος πήξης χωρίς διαταραχές ινωδόλυσης και μεταβολή της αορτικής σκληρίας. Επιπλέον, η τρίμηνη αντιυπερτασική αγωγή με ανταγωνιστή των υποδοχέων της αγγειοτενσίνης-ΙΙ είχε ως αποτέλεσμα τη σημαντική μείωση της ενεργοποίησης των αιμοπεταλίων και του συστήματος πήξης, την ενίσχυση της ινωδόλυσης και την επάνοδο της απόκρισης της αορτικής σκληρίας σε επίπεδα αντίστοιχα με αυτά των υγιών εθελοντών. Κατά τη διερεύνηση των υποκείμενων λειτουργικών και δομικών αγγειακών διαταραχών στους υπερτασικούς ασθενείς, σημαντικός αποδείχθηκε ο ρόλος των hsCRP, καρδιοτροφίνης-1 και ADMA. Οι δείκτες αυτοί βρέθηκαν σημαντικά αυξημένοι στους υπερτασικούς ασθενείς και συσχετίστηκαν με δείκτες αορτικής σκληρίας.