Παράγωγα της χλωραμφαινικόλης ως αντιβακτηριακά φάρμακα και ως εργαλεία μελέτης της δομής και της λειτουργίας του καταλυτικού κέντρου του ριβοσώματος

Abstract

Protein synthesis is a major target for antibiotics. Chloramphenicol (CAM) binds on the large ribosomal subunit and inhibits bacterial fundamental functions, such as the peptide bond formation, the binding of the tRNA-substrates in the A-site and the termination of the peptide chain synthesis. The presence of active trans-membrane transporters for polyamines in cells and crystallographic data that show two binding sites for CAM on the ribosome gave us the impetus to create two series of CAM derivatives: polyamine and dimer derivatives, respectively. The aim of this study was to re-examine the complex behavior of chloramphenicol binding to ribosomes, using time-resolved footprinting analysis, and to synthesize a series of dimers and polyamine derivatives of chloramphenicol along with evaluating their antibacterial and antitumor activity, with the expectation to find new drugs with stronger affinity against the ribosome, better ability to enter to cells and less toxicity to normal cells, compared with the parent compound. Kinetic analysis experiments were performed in a cell-free system derived from E. coli, in which acetylphenylalanyl-puromycin is produced via a pseudo-first-order reaction between complex C, i.e. acetylphenylalanyl-tRNA•poly(U)•ribosome (acting as an analog of the initiator translation complex) and puromycin in excess (acting as a pseudo-substrate of the A-site). The polyamine derivatives and dimers of CAM were studied as inhibitors of this reaction and their kinetic behavior was compared with those of the parent compound. We observed that in the absence of inhibitor, the puromycin reaction follows classical first-order kinetics (monophasic semi-logarithmic time-plots). However, in the presence of CAM derivatives, the reaction followed kinetics of time-dependent inhibition (biphasic semi-logarithmic time-plots). Data processing revealed that the CAM derivatives behave as slow binding inhibitors. Based on the overall inhibition constant, Κi*, the polyamine derivatives were classified as follows: KA240 (Κi* = 0.28 μΜ) and F5 (Κi* = 0.75 μΜ), both bearing a spermidine molecule attached to the CAM scaffold, and CLB3 (Κi* = 0.6 μΜ) that instead bears a spermine molecule were able to bind to the ribosome more tightly than the parent compound (Κi* = 0.88 μΜ) to the ribosome. Among the dimers, mag240 that possesses a six-carbons linker with limited conformational freedom, and mag261 that possesses a three-carbons linker were found to be the strongest inhibitors. Footprinting analysis studies confirmed that the derivatives of CAM follow two-step binding mechanism, since the footprint of the initial and final complex differed, thus allowing to investigate the entire course of the binding process. The chemical protection of nucleotides A2451 and U2506, which are located in the catalytic center, justifies the competitive mode of inhibition exhibited by the polyamine derivatives and dimers of CAM in the puromycin reaction. The polyamine derivative KA240 and the parent compound were found to additionally protect A2059 and A2062 through allosteric phenomena, given that the length of these molecules does not allow a direct contact with the exit tunnel. On the other hand, dimers (mag240 and mag234) protect the nucleotides of the exit tunnel A2058, A2059 and A2062, with mag240 showing stronger protection, probably due to the lower possibility of rotation of the molecule around the arm linking the two CAM scaffolds. Apart from the in vitro experiments, we performed a series of experiments in bacteria and in human cell lines. The study of the effect of the derivatives in cultures of E. coli and S. aureus cells demonstrated that CAM derivatives access easier Gram-positive than Gram-negative bacteria. However, none of the derivatives show a stronger antibacterial activity than the parent compound. Taking into account that chloramphenicol may impact the eukaryotic mitochondria and specifically may inhibit mitochondrial protein synthesis, we investigated whether the parent compound and the most active members in vitro of each series of derivatives are toxic to human hematopoietic cell lines (Jurkat, HS-Sultan, U937) and lung cell lines. Preliminary measurements using the blood analyzer showed that none of the three antibiotics is toxic to mature blood cells, after 120h- exposure at 6 μM of each drug. They also showed that CAM inhibits Jurkat (T leukemia line) cell growth by 13%, KA240 by 26% and mag240 by 31%. In cell culture HS-Sultan (B-leukemia line), the toxic effects of the drugs were different: CAM inhibited cell growth by 30%, KA240 by 15% and mag240 by 10 %. U937 (monocytic cell line) cultured cells were not sensitive to any of the investigated drugs. Further experimentation using propidium iodide (calculation of necrosis) and CFSE (calculation of proliferating cells) showed that the observed reduction of cell growth was not due to cell death, but to inhibition of cell divisions. Finally, CAM and mag240 showed no toxic effect on Met5A (transformed epithelial cells) and Zl34 (mesothelioma cancer cells), contrary to KA240 that was active against Zl34 cells. In conclusion, in the present study we investigated the mechanism of action and we determined the antibacterial effect of a series of CAM derivatives in cultures of Gram-positive and Gram-negative bacteria. Although none of the derivatives showed stronger in vivo activity than those of the parent compound, the investigation of their activity in cell free systems led to important conclusions about the properties of the catalytic center of the ribosome. The most important of them concern the ability of the catalytic center to form its structure, to receive successfully a ligand (induced fitting) and to transfer allosteric messages to remote spatial regions. An important finding was the identification of a second binding site of the CAM at the entrance of the exit tunnel, which has low affinity and can only be detected using ligands with restricted conformation. Finally, measurements of the toxicity of these substances in various eukaryotic cells revealed that some of them, although inactive against normal human cells, exhibit anti-proliferative effects on tumor cells. This finding paves the way for further investigation of these substances as promising anticancer compounds.

Η πρωτεϊνική σύνθεση είναι ένας σημαντικός στόχος για τα αντιβιοτικά. Η χλωραμφαινικόλη (CAM) δεσμεύεται επί της μεγάλης ριβοσωματικής υπομονάδας των βακτηρίων και παρεμποδίζει θεμελιώδεις λειτουργίες, όπως είναι η σύνθεση του πεπτιδικού δεσμού, η πρόσδεση των tRNA-υποστρωμάτων στην Α-θέση και ο τερματισμός της πεπτιδικής αλυσίδας. Η παρουσία ενεργών διαμεμβρανικών μεταφορέων για πολυαμίνες στα κύτταρα και κρυσταλλογραφικά δεδομένα που παρουσιάζουν δύο θέσεις πρόσδεσης της CAM στο ριβόσωμα μας έδωσαν το έναυσμα για τη δημιουργία δύο κατηγοριών παραγώγων των πολυαμινικών και των διμερών, αντίστοιχα. Στόχος της παρούσας διατριβής ήταν η επανεξέταση της πολύπλοκης συμπεριφοράς της χλωραμφαινικόλης, χρησιμοποιώντας την τεχνική της χρονο-διαβαθμισμένης αποτύπωσης, καθώς και τη σύνθεση και εκτίμηση της αντιβακτηριακής και αντικαρκινικής δράσης μιας σειράς πολυαμινικών και διμερών παραγώγων της χλωραμφαινικόλης, με αναμενόμενη ισχυρότερη συγγένεια προς το ριβόσωμα και βελτιωμένη ικανότητα εισόδου στα κύτταρα, συγκριτικά με τη μητρική ένωση. Τα πειράματα κινητικής ανάλυσης, έγιναν σε ένα σύστημα ελεύθερο-κυττάρων του εντεροβακτηρίου E. coli, όπου η σύνθεση ακετυλο-φαινυλαλανυλο-πουρομυκίνης πραγματοποιείται μέσω μιας αντίδρασης ψευδοπρώτης τάξεως μεταξύ του συμπλέγματος C, δηλαδή ακετυλο-φαινυλαλανυλο-tRNA•poly(U) •ριβοσωμάτων (δρα ως ανάλογο του εναρκτήριου μεταφραστικού συμπλόκου) και περίσσειας πουρομυκίνης (δρα ως υπόστρωμα της Α-θέσης). Τα πολυαμινικά όσο και τα διμερή παράγωγα μελετήθηκαν ως αναστολείς της αντίδρασης πουρομυκίνης και η κινητική τους συμπεριφορά συγκρίθηκε με εκείνη της μητρικής ένωσης. Αρχικά, παρατηρήσαμε ότι απουσία αναστολέα, οι αντιδράσεις ακολουθούσαν κλασσική κινητική πρώτης τάξης (μονοφασικές ημι-λογαριθμικές χρονοκαμπύλες). Ωστόσο, η παρουσία των παραγώγων είχε ως αποτέλεσμα τα δεδομένα να υποστηρίζουν κινητική χρονοεξαρτώμενης αναστολής (διφασικές ημι-λογαριθμικές χρονοκαμπύλες). Ακολούθησε ενδελεχής κινητική ανάλυση, η οποία αποκάλυψε ότι τα παράγωγα συμπεριφέρονται ως αναστολείς βραδείας δέσμευσης. Με βάση την ολική σταθερά αναστολής, Κi*, κατατάξαμε τα πολυαμινικά παράγωγα ως εξής: το ΚΑ240 (Κi*= 0,28 μΜ) και το F5 (Κi*= 0,75 μΜ) που φέρουν μία σπερμιδίνη προσκολλημένη στο μόριο της CAM, και το CLB3 (Κi*= 0,6 μΜ) που φέρει μια σπερμίνη, προσδένονται πιο ισχυρά από τη μητρική ένωση (Κi*= 0,88 μΜ) στο ριβόσωμα. Από τα διμερή ισχυρότερα είναι το mag240 (Κi*= 0,3 μΜ) που φέρει συνδέτη με περιορισμένη διαμορφωτική ελευθερία και έξι άτομα άνθρακα και τα mag261 (Κi*= 0,6 μΜ) και mag266 (Κi*= 0,75 μΜ) τα οποία φέρουν βραχύτερο συνδέτη. Μελέτες ανάλυσης αποτυπώματος επιβεβαίωσαν ότι τα παράγωγα της CAM ακολουθούν μηχανισμό πρόσδεσης δύο σταδίων, αφού το αποτύπωμα του αρχικού και τελικού συμπλόκου διέφερε, παρέχοντας έτσι τη δυνατότητα παρακολούθησης της πορείας πρόσδεσης. Η χημική προστασία που παρέχει η πρόσδεση στα νουκλεοτίδια Α2451 και U2506, που βρίσκονται στο καταλυτικό κέντρο, δικαιολογεί το συναγωνιστικό χαρακτήρα αναστολής των πολυαμινικών και διμερών παραγώγων της CAM στην αντίδραση πουρομυκίνης. Το πολυαμινικό παράγωγο ΚΑ240 και η μητρική ένωση φαίνεται να προστατεύουν τα Α2059 και Α2062 μέσω αλλοστερικού φαινομένου αφού το μήκος των μορίων τους δεν τους επιτρέπει να φτάσουν στο κανάλι εξόδου. Από την άλλη πλευρά, τα διμερή παράγωγα (mag240 και mag234) προστατεύουν τα νουκλεοτίδια του καναλιού εξόδου Α2058, Α2059, Α2062, με το mag240 να δείχνει ισχυρότερη προστασία, πιθανότατα λόγω μικρότερης δυνατότητας περιστροφής του μορίου γύρω από το βραχίονα που συνδέει τις δύο πολυαμινικές ομάδες. Εκτός από τα in vitro πειράματα πραγματοποιήσαμε και μια σειρά πειραμάτων σε βακτήρια και σε ανθρώπινες κυτταρικές σειρές. Η μελέτη της επίδρασης των παραγώγων σε καλλιέργειες στελεχών Ε. coli και S. aureus κατέδειξε ότι τα παράγωγα της CAM εισέρχονται πιο εύκολα στα θετικά κατά Gram σε σχέση με τα αρνητικά κατά Gram βακτήρια. Όμως, κανένα από τα παράγωγα δεν επέδειξε ισχυρότερη αντιβακτηριακή δράση από τη μητρική ένωση. Με βάση την υπόθεση ότι η χλωραμφαινικόλη δρα στα μιτοχόνδρια και συγκεκριμένα αναστέλλει την πρωτεϊνική σύνθεσή τους, διερευνήθηκε αν η μητρική ένωση και το δραστικότερο in vitro παράγωγο της κάθε σειράς είναι τοξικό σε ανθρώπινες λευχαιμικές κυτταρικές σειρές (Jurkat, HS-Sultan, U937) και σε κυτταρικές σειρές πνεύμονα. Αρχικές μετρήσεις με τον αναλυτή αίματος έδειξαν ότι: κανένα εκ των τριών αντιβιοτικών δεν είναι τοξικό σε ώριμα κύτταρα του αίματος σε συγκέντρωση 6 μΜ και για έκθεση 120 h. Επίσης, έδειξαν ότι η CAM αναστέλλει την ανάπτυξη κυττάρων Jurkat (Τ-λευχαιμική σειρά) κατά 13%, το ΚΑ240 κατά 26% και το mag240 κατά 31%. Σε καλλιέργεια κυττάρων HS-Sultan (Β-λευχαιμική σειρά), η συμπεριφορά των αντιβιοτικών ήταν διαφορετική: η CAM ανέστειλε την ανάπτυξη των κυττάρων κατά 30%, το ΚΑ240 κατά 15% και το mag240 κατά 10%. Σε καλλιέργεια κυττάρων U937 (μονοκυτταρική σειρά) τα αντιβιοτικά μας δεν έδειξαν κάποια τοξική δράση. Περαιτέρω μελέτη των κυτταρικών σειρών με ιωδιούχο προπίδιο (υπολογισμός νέκρωσης) και CFSE (υπολογισμός πολλαπλασιαζόμενων κυττάρων) έδειξε ότι η μείωση των κυττάρων δεν οφείλεται σε νέκρωση, αλλά σε ανάσχεση των κυτταρικών διαιρέσεων. Τέλος, η CAM και το mag240 δεν έδειξαν τοξική δράση στις κυτταρικές σειρές Μet5Α (επιθηλιακά μετασχηματισμένα κύτταρα) και Zl34 (κύτταρα από καρκίνο μεσοθηλιώματος), σε αντίθεση με το ΚΑ240, το οποίο ήταν δραστικό έναντι της καρκινικής σειράς. Συμπερασματικά, στην παρούσα μελέτη διερευνήσαμε το μηχανισμό δράσης και προσδιορίσαμε την αντιβακτηριακή ισχύ μιας σειράς παραγώγων της CAM σε καλλιέργειες θετικών και αρνητικών κατά Gram βακτηρίων. Αν και κανένα από τα παράγωγα δεν έδειξε ισχυρότερη in vivo δράση από εκείνη της μητρικής ένωσης, η διερεύνηση του μηχανισμού δράσης τους in vitro οδήγησε σε σπουδαία συμπεράσματα για τις ιδιότητες του καταλυτικού κέντρου του ριβοσώματος. Τα σπουδαιότερα εξ’ αυτών αφορούν στην ικανότητα του καταλυτικού κέντρου να διαμορφώνει τη στερεοδομή του, ώστε να υποδέχεται επιτυχώς ένα προσδέτη (induced fitting) και να μεταφέρει αλλοστερικά μηνύματα σε απομακρυσμένες χωροταξικά περιοχές. Επίσης, σημαντικό συμπέρασμα ήταν η ταυτοποίηση μιας δεύτερης θέσης πρόσδεσης της CAM στην είσοδο του καναλιού εξόδου, μικρής συγγένειας, η οποία μπορεί να αποκαλυφθεί μόνο με τη χρήση προσδετών με περιορισμένη στερεοδιαμόρφωση. Τέλος, από τη μελέτη της τοξικότητας των εν λόγω ουσιών σε ευκαρυωτικά κύτταρα διαπιστώθηκε ότι μερικά εξ αυτών, παρότι ανενεργά έναντι φυσιολογικών ανθρωπίνων κυττάρων, προκαλούν ανάσχεση στην πολλαπλασιαστική ικανότητα καρκινικών κυττάρων. Αυτό το γεγονός δίνει το έναυσμα για περαιτέρω μελέτη αξιοποίησης των εν λόγω ουσιών ως αντικαρκινικών.