Wild boar as a source of selected emerging and re-emerging pathogens: application of microarray technologies

Abstract

SUMMURYChapter 1- IntroductionThe introduction of the present thesis starts with a review of the current knowledge on the most important viral, bacterial and parasitic infections of wild boar, with a focus on their diagnosis, followed by a description of novel diagnostic technologies, namely microarrays and multiplex bead assay.Chapter 2 - A serosurvey for selected pathogens in Greek European wild boar The aim of this study was to investigate the seroprevalence rate for 10 selected pathogens, important for livestock and/or public health, in wild boar from different areas of Greece and to correlate results with environmental factors using a geographical information system.Serum samples, collected from 94 European wild boar (Sus scrofa) during the hunting seasons 2006-2010, were examined. The assays used were commercial indirect enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for the detection of antibodies against porcine circovirus-2 (PCV-2), porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus, Aujeszky’s disease virus, influenza A virus, Actinobacillus pleuropneumoniae, Mycoplasma hyopneumoniae, Salmonella spp, Trichinella spp and indirect immunofluorescence antibody (IFA) test for the detection of antibodies against Toxoplasma gondii and Neospora caninum. The sample collection area was located in the field using handheld Global Positioning System (GPS) units or longitude and latitude information. GIS layers were created to represent the geographic locations of the sampling and of the nearest free-ranging swine farms. Cluster analysis for seropositivity to at least one of the pathogens was performed. Also, the relationships between seropositivity to each pathogen and wild boar sex, selected environmental variables (altitude, distance from the nearest free-ranging swine farms, land use, land cover) and density of wild boar population was examined. Antibodies against PCV-2, PRRS virus, Aujeszky disease virus, influenza A virus, A. pleuropneumoniae, M. hyopneumoniae, Salmonella spp, Trichinella spp, T. gondii and N. caninum were detected in 19.1%, 12.8%, 35.1%, 1.1%, 57.4%, 0%, 4.3%, 6.4%, 5.2% and 1.1% of the samples, respectively. Cluster analysis revealed a hot spot of seropositivity near Bulgarian border. Seropositivity to Aujeszky’s disease virus was more common among female animals. There were no significant associations between environmental factors (altitude, distance from the nearest free-ranging swine farms, land use, land cover) or density of wild boar population and seropositivity with the only exception of PRRS virus where a borderline association with land cover (p=0.05) was found (higher seopositivity in cultivated and managed areas). These results indicate exposure of wild boar to most of these pathogens, raising concern about the possibility that this species may pose a significant health risk for livestock and/or humans.Chapter 3 - Development of a multiplex bead assay for the detection of serological responses to Brucella species that overcomes the cross-reactivity with Yersinia enterocolitica O:9 in domestic pig and wild boar populationThe aim of this study was to develop a multiplex bead assay using a rough Brucella lipopolysaccharide (rLPS) antigen, a whole cell Brucella suis 1330 smooth antigen, and a whole cell Yersinia enterocolitica O:9 antigen, that not only discriminates Brucella seropositive from Brucella seronegative domestic pigs and wild boar but also overcomes the cross reactivity with Y. enterocolitica O:9.One hundred twenty six domestic pig sera allocated into three groups were used: Group A (Brucella infected) containing 29 sera collected from pigs confirmed by culture to be infected with B. suis biovar 2 (25/29) or biovar 1 (4/29). Group B (non Brucella infected) containing 80 randomly selected sera collected from herds within Great Britain. Great Britain is officially brucellosis-free. Group C containing 17 sera from Great Britain confirmed as false positive serological reactors (FPSR) during routine testing. Additional 49 Eurasian wild boar sera allocated into two groups: group A containing 18 positive (Brucella seropositive) and group B containing 31 negative (Brucella seronegative) sera were included in the study. Twenty six of the 29 Brucella infected domestic pigs (23/25 Brucella infected by biovar 2 and 3/4 infected by biovar 1) were shown to be positive using the rLPS antigen, while all (17/17) FPSR domestic pigs and 75/ 80 non Brucella infected domestic pigs were negative. The same antigen detected 15/18 of the seropositive and it was negative in all (31/31) of the confirmed seronegative wild boar sera. The smooth B. suis 1330 antigen detected all (29/29) Brucella infected domestic pigs, was negative in all (80/80) non Brucella infected, however, it showed positive reactions in in most (13/17) FPSR. In wild boar the same antigen detected all (18/18) seropositive and it was negative in 30/31 seronegative animals. Finally, the ratio of the smooth B. suis 1330 and the smooth Y. enterocolitica O:9 normalized median fluorescence intensity (MFI) values discriminated with 100% sensitivity and 100% specificity Brucella infected from the FPSR domestic pigs. These results demonstrate the potential of the multiplex bead assay for use in surveillance of brucellosis in pigs and wild boar and furthermore, it has a potential to overcome the cross-reactivity with Y. enterocolitica.Chapter 4 - Diagnostic performance of a multiplex bead assay and a serology microarray technology as serodiagnostic tools for the simultaneously detection of antibodies against Mycobacterium bovis, Brucella suis and Trichinella spiralis in wild boarThe aim of this study was to evaluate the diagnostic performance of two multiplexed assays, a multiplex bead assay and a serology microarray technology, for the simultaneous detection of antibodies against Mycobacterium bovis, Brucella suis and Trichinella spiralis and to compare it with that of conventional single-pathogen indirect “in house” ELISAs for bovine tuberculosis and porcine brucellosis and with a commercial ELISA for wild boar trichinellosis.One hundred sixty nine sera from Eurasian wild boar of known TB serology status (64 seropositive, 105 seronegative), 68 sera of known Brucella serology status (29 seropositive, 39 seronegative) and 118 sera of known trichinelosis status (21 seropositive, 97 seronegative) were usedfor the development and the evaluation of the multiplex bead assay and for the evaluation of the serology microarray. A recombinant MPB83 antigen, a whole cell B. suis 1330 antigen and an E/S T. spiralis antigen were used for the development and the evaluation of the multiplex bead assay. A developed microarray chip containing 116 different antigens of 63 different viral, bacterial and parasitic pathogens, including the above antigens, was evaluated. Due to the lack of commercial availability of tests for detection of antibodies against tuberculosis and brucellosis in wild boar, “in house” ELISAs were performed using the recombinant MPB83 antigen and the whole cell B. suis 1330 antigen. The results for each antigen (MPB83, B. suis 1330 and E/S T. spiralis) were compared among the serological assays (multiplex bead assay, serology microarray technology, “in house” ELISA) as well as between each serological assay and the gold standard.The multiplex bead assay discriminated TB seropositive from seronegative wild boar with sensitivity (Se) of 98.4% and specificity (Sp) of 85.7%, whereas the corresponding values for brucellosis were 100% and 97.4%, respectively and for trichinellosis 90.5% and 99%, respectively. Comparable results were obtained with the serology microarray technology (Se and Sp of 92% and 92.4% for TB, of 100% and 91.7% for B. suis and of 75% and 98.7% for T. spiralis). Most of the results for the multiplexed serological assays agreed with the gold standard ELISA results, with exception of the multiplex bead assay’s results for TB.Chapter 5 – Final comments and future perspectivesIn this chapter the reasons that wild boar should be included in surveillance and monitoring programmes at national level and the potential of microarray technology and multiplex bead assay as serological tools are summarized.

ΠΕΡΙΛΗΨΗΚεφάλαιο 1 – ΕισαγωγήΗ εισαγωγή της παρούσας διδακτορικής διατριβής περιλαμβάνει την ανασκόπηση των σύγχρονων δεδομένων για σημαντικά ιογενή, βακτηριακά και παρασιτικά νοσήματα των αγριόχοιρων, με έμφαση στη διάγνωσή τους, καθώς και την περιγραφή νέων διαγνωστικών τεχνολογιών και συγκεκριμένα των μικροσυστοιχιών και της πολυσύνθετης δοκιμής μαγνητικών σφαιριδίων.Κεφάλαιο 2 – Μία ορολογική μελέτη για επιλεγμένα παθογόνα στους ελληνικούς αγριόχοιρουςΟ σκοπός της μελέτης αυτής ήταν να διερευνηθεί η συχνότητα της οροθετικότητας των αγριογούρουνων από διάφορες περιοχές της Ελλάδας έναντι 10 επιλεγμένων παθογόνων, σημαντικών για τα οικόσιτα ζώα ή τον άνθρωπο και να συσχετιστούν τα αποτελέσματα με περιβαλλοντικούς παράγοντες, που παρέχονται μέσω συστήματος γεωγραφικών πληροφοριών (ΣΓΠ). Εξετάστηκαν δείγματα ορών, που συλλέχθηκαν από 94 αγριόχοιρους κατά τη διάρκεια των κυνηγετικών περιόδων 2006-2010. Οι ορολογικές εξετάσεις που χρησιμοποιήθηκαν ήταν εμπορικά διαθέσιμες έμμεσες ανοσοενζυματικές δοκιμές ανοσοπροσρόφησης (ELISA) για την ανίχνευση αντισωμάτων έναντι του κυκλοϊού-2 του χοίρου, του ιού του αναπαραγωγικού και αναπνευστικού συνδρόμου του χοίρου (ΑΑΣΧ), του ιού της νόσου του Aujeszky, της γρίπης τύπου Α των χοίρων, των βακτηρίων Actinobacillus pleuropneumoniae, Mycoplasma hyopneumoniae, Salmonella spp και του παρασίτου Trichinella spp και ο έμμεσος ανοσοφθορισμός (IFAT) για την ανίχνευση αντισωμάτων έναντι των παρασίτων Toxoplasma gondii and Neospora caninum. Οι περιοχές απ’ όπου συλλέχθηκαν τα δείγματα, τοποθετήθηκαν στο πεδίο με τη χρήση του παγκοσμίου συστήματος εντοπισμού θέσης ή με τη χρήση πληροφοριών γεωγραφικού μήκους και πλάτους. Ένα ψηφιακό επίπεδο πληροφοριών δημιουργήθηκε ώστε να αντιπροσωπεύει τις γεωγραφικές θέσεις συλλογής των δειγμάτων καθώς και τη θέση των πλησιέστερων αγροκτημάτων ημιεκτατικής εκτροφής χοίρων. Πραγματοποιήθηκε ανάλυση της διασποράς της οροθετικότητας για τουλάχιστον ένα από τα εξεταζόμενα παθογόνα. Επίσης διερευνήθηκε τυχόν συσχετισμός μεταξύ της οροθετικότητας για κάθε παθογόνο ξεχωριστά με το φύλο των αγριόχοιρων, διάφορους περιβαλλοντικούς παράγοντες (υψόμετρο, απόσταση από το κοντινότερο αγρόκτημα ημιεκτατικής εκτροφής χοίρων, χρήση και κάλυψη της γης) καθώς και με την πυκνότητα του πληθυσμού των αγριόχοιρων. Αντισώματα έναντι του κυκλοϊού-2 του χοίρου, του ιού του ΑΑΣΧ, του ιού της νόσου του Aujeszky, των ιών γρίπης τύπου Α των χοίρων, των A. pleuropneumoniae, M. hyopneumoniae, Salmonella spp, Trichinella spp, T. gondii και N. caninum ανιχνεύθηκαν σε ποσοστό 19,1%, 12,8%, 35,1%, 1,1%, 57,4%, 0%, 4,3%, 6,4%, 5,2% και 1,1% των δειγμάτων, αντίστοιχα. Η ανάλυση διασποράς κατέδειξε ως περιοχές έντονης οροθετικότητας, τις περιοχές που συνορεύουν με τη Βουλγαρία. Η οροθετικότητα έναντι του ιού της νόσου του Aujeszky ήταν μεγαλύτερη στους θηλυκούς αγριόχοιρους ενώ δε βρέθηκε συσχέτιση μεταξύ της οροθετικότητας και των περιβαλλοντικών παραγόντων ή της πυκνότητας του πληθυσμού των αγριόχοιρων, με μόνη εξαίρεση το ΑΑΣΧ που φαίνεται να συσχετίζεται οριακά (p=0.05) με την κάλυψη γης (υψηλότερη οροθετικότητα σε καλλιεργήσιμες και διαχειριζόμενες περιοχές). Τα αποτελέσματα αυτά καταδεικνύουν έκθεση των αγριόχοιρων στα περισσότερα από τα παραπάνω παθογόνα, γεγονός που δημιουργεί υπόνοια πως το ζωικό αυτό είδος μπορεί να αποτελεί σημαντικό κίνδυνο για τα οικόσιτα ζώα ή τη Δημόσια Υγεία.Κεφάλαιο 3 – Ανάπτυξη μιας πολλαπλής τεχνικής μαγνητικών σφαιριδίων (multiplex bead assay) για την ανίχνευση ορολογικών αντιδράσεων έναντι των ειδών Brucella, παρεμποδίζοντας τη διασταυρούμενη αντίδραση με την Yersinia enterocolitica O:9 σε οικόσιτους χοίρους και αγριόχοιρους.Ο σκοπός της μελέτης αυτής ήταν η ανάπτυξη μιας πολλαπλής τεχνικής μαγνητικών σφαιριδίων με 3 αντιγόνα [εκχύλισμα λιποπολυσακχαρίτη κυτταρικού τοιχώματος Brucella R φάσης (rLPS), ολόκληρο κύτταρο Brucella S φάσης (B. suis 1330 smooth) και ολόκληρο κύτταρο Yersinia enterocolitica O:9.] η οποία να διαχωρίζει τα Brucella οροθετικά από τα Brucella οροαρνητικά ζώα και να ανιχνεύει τις διασταυρούμενες αντιδράσεις με την Y. enterocolitica O:9.Χρησιμοποιήθηκαν 126 οροί οικόσιτων χοίρων οι οποίοι διαχωρίστηκαν σε 3 ομάδες. Η ομάδα Α (Brucella θετικοί) περιελάμβανε 29 ορούς από μολυσμένους και θετικούς στην καλλιέργεια χοίρους. Συγκεκριμένα, 25 από αυτά τα ζώα, προερχόμενα από την Ισπανία, ήταν μολυσμένα από το στέλεχος B.suis biovar 2 και τέσσερα, προερχόμενα από τη Νότιο Αμερική, ήταν μολυσμένα από το στέλεχος B. suis biovar 1. Η ομάδα Β (Brucella αρνητικοί) περιελάμβανε 80 τυχαία επιλεγμένους ορούς από χοίρους από τη Μεγάλη Βρετανία, η οποία είναι απαλλαγμένη από τη νόσο. Η ομάδα Γ περιελάμβανε 17 ορούς από κοπάδια της Μεγάλης Βρετανίας, που βρέθηκαν ψευδώς θετικοί, ύστερα από εξέταση με κοινές ορολογικές τεχνικές. Επίσης χρησιμοποιήθηκαν 49 οροί αγριόχοιρων από την Ισπανία, οι οποίοι διαχωρίστηκαν σε 2 ομάδες. Η ομάδα Α (Brucella οροθετικοί) περιελάμβανε 18 ορούς, ενώ η ομάδα Β (Brucella οροαρνητικοί) περιελάμβανε 31 ορούς.Το αντιγόνο rLPS ανίχνευσε 26 από τους 29 Brucella θετικούς οικόσιτους χοίρους (23/25 μολυσμένους από Β. suis biovar 2 και 3/4 μολυσμένους από B.suis biovar 1), ενώ όλοι οι ψευδώς θετικοί οροί (17/17) και 75/80 Brucella αρνητικοί οροί ήταν αρνητικοί. Το ίδιο αντιγόνο ανίχνευσε 15/18 οροθετικούς αγριόχοιρους, ενώ ήταν αρνητικό για όλους τους οροαρνητικούς (31/31). Το αντιγόνο B. suis 1330 ανίχνευσε όλους τους θετικούς οικόσιτους χοίρους (29/29), ήταν αρνητικό για όλους τους αρνητικούς (80/80), αλλά ήταν θετικό για 13/17 ψευδώς θετικούς ορούς. Στους αγριόχοιρους, το ίδιο αντιγόνο ανίχνευσε όλους τους οροθετικούς (18/18) και ήταν αρνητικό για 30/31 οροαρνητικούς. Τέλος, η αναλογία των τιμών διάμεσης έντασης φθορισμού (MFI) μεταξύ του αντιγόνου B. suis 1330 και του αντιγόνου της Y. enterocolitica O:9 διαχώρισε πλήρως τους Brucella θετικούς οικόσιτους χοίρους από τους ψευδώς θετικούς (ευαισθησία:100%, ειδικότητα:100%).Τα αποτελέσματα αυτά δείχνουν τη δυνατότητα εφαρμογής της πολλαπλής τεχνικής μαγνητικών σφαιριδίων για την επιτήρηση της βρουκέλλωσης στους οικόσιτους χοίρους και στους αγριόχοιρους, καθώς και την ικανότητά της να ανιχνεύει τη διασταυρούμενη αντίδραση με την Y. enterocolitica στους οικόσιτους χοίρους.Κεφάλαιο 4 – Η διαγνωστική αξία μίας πολλαπλής τεχνικής μαγνητικών σφαιριδίων (multiplex bead assay) και μίας τεχνολογίας μικροσυστοιχιών (microarray technology) ως οροδιαγνωστικών εργαλείων για την ταυτόχρονη ανίχνευση αντισωμάτων έναντι των παθογόνων Mycobacterium bovis, Brucella suis and Trichinella spiralis στους αγριόχοιρους.Ο σκοπός της μελέτης αυτής ήταν να εκτιμηθεί η διαγνωστική αξία δύο πολυσύνθετων τεχνικών, μίας πολλαπλής τεχνικής μαγνητικών σφαιριδίων (multiplex bead assay) και μίας τεχνολογίας ορολογικών μικροσυστοιχιών (serology microarray), για την ταυτόχρονη ανίχνευση αντισωμάτων έναντι των παθογόνων Mycobacterium bovis, Brucella suis and Trichinella spiralis και να συγκριθούν τα αποτελέσματά τους με δύο συμβατικές τεχνικές ανοσοενζυμικής ανοσοπροσρόφησης (“in house” ELISA), μία για τη φυματίωση και μία για τη βρουκέλλωση, καθώς και με μία εμπορικά διαθέσιμη ELISA για την ανίχνευση αντισωμάτων κατά της τριχινέλωσης στους αγριόχοιρους.Εκατόν εξήντα εννιά οροί αγριόχοιρων από την Ισπανία με γνωστό ορολογικό προφίλ φυματίωσης (64 θετικοί, 105 αρνητικοί) χρησιμοποιήθηκαν για την ανάπτυξη και την εκτίμηση της διαγνωστικής αξίας του multiplex bead assay και την εκτίμηση της διαγνωστικής αξίας του serology microarray. Για τον ίδιο σκοπό, χρησιμοποιήθηκαν 68 οροί αγριόχοιρων από την Ισπανία με γνωστό ορολογικό προφίλ για την βρουκέλλωση (29 θετικοί, 39 αρνητικοί) και 118 οροί αγριόχοιρων από την Ισπανία και την Ελλάδα με γνωστό ορολογικό προφίλ για την τριχινέλλωση (21 οροθετικοί, 97 οροαρνητικοί).Τα αντιγόνα που χρησιμοποιήθηκαν για την ανάπτυξη και την εκτίμηση της διαγνωστικής αξίας του multiplex bead assay ήταν ένα ανασυνδυασμένο αντιγόνο MPB83 για τη φυματιώση, ολόκληρο κύτταρο Brucella S φάσης (B. suis 1330) για τη βρουκέλλωση και το E/S T. spiralis για τη τριχινέλλωση. Επιπλέον, εκτιμήθηκε η διαγνωστική αξία μίας ήδη ανεπτυγμένης τεχνολογίας ορολογικών μικροσυστοιχιών (serology microarray), η οποία περιείχε 116 διαφορετικά αντιγόνα, μεταξύ των οποίων ήταν και τα παραπάνω, για την ανίχνευση αντισωμάτων έναντι 63 ιϊκών, βακτηριακών και παρασιτικών παθογόνων. Λόγω του ότι δεν υπάρχουν εμπορικά διαθέσιμες ELISA για την ανίχνευση αντισωμάτων έναντι της βρουκέλλωσης και της φυματίωσης των αγριόχοιρων, αναπτύξαμε στο εργαστήριο δυο τεχνικές ELISA (“in house” ELISA), χρησιμοποιώντας στη μία το αντιγόνο MPB83 και στην άλλη το B. suis 1330. Τα αποτελέσματα του κάθε αντιγόνου (MPB83, B. suis 1330 , E/S T. spiralis) συγκρίθηκαν μεταξύ των ορολογικών τεχνικών που χρησιμοποιήθηκαν (πολλαπλή τεχνικής μαγνητικών σφαιριδίων, τεχνολογίας ορολογικών μικροσυστοιχιών, ELISA), καθώς και μεταξύ των ορολογικών τεχνικών και των μεθόδων αναφοράς.Η πολλαπλή τεχνική μαγνητικών σφαιριδίων διαχώρισε τους οροθετικούς στη φυματίωση αγριόχοιρους από τους οροαρνητικούς με ευαισθησία 98,4% και ειδικότητα 85,7%, ενώ οι αντίστοιχες τιμές για τη βρουκέλλωση ήταν 100% και 97,4% και για την τριχινέλλωση 90,5% και 99%. Ομοίως, η ευαισθησία και η ειδικότητα τεχνολογίας ορολογικών μικροσυστοιχιών ήταν ικανοποιητικές (92% και 92,4% για τη φυματίωση, 100% και 91,7% για τη βρουκέλλωση και 75% και 98,7% για την τριχινέλλωση, αντίστοιχα). Τα αποτελέσματα και των δύο τεχνικών δεν διέφεραν στατιστικά από τις μεθόδους αναφοράς, με μόνη εξαίρεση τα αποτελέσματα της πολλαπλής τεχνικής μαγνητικών σφαιριδίων για τη φυματίωση, αλλά ούτε από τα αποτελέσματα της ELISA.Κεφάλαιο 5 – Καταληκτικά σχόλια και μελλοντικές έρευνεςΣτο κεφάλαιο αυτό συνοψίζονται οι λόγοι για τους οποίους είναι απαραίτητη η διαρκής παρακολούθηση της έκθεσης των αγριόχοιρων σε διάφορους παθογόνους παράγοντες, σε εθνικό επίπεδο, καθώς και η διαγνωστική αξία της πολλαπλής τεχνικής μαγνητικών σφαιριδίων και της τεχνολογίας ορολογικών μικροσυστοιχιών.