Ποσοτικός προσδιορισμός στεροειδών ορμονών και των μεταβολιτών τους στη συστηματική κυκλοφορία γυναικών με καλοήθεις και κακοήθεις παθήσεις του μαστού καθώς και υγιών, με σύγχρονες αναλυτικές τεχνικές

Abstract

Steroid hormones affect major biological functions and play a critical role in breast carcinogenesis. They are potent enough so as to exert significant effects even at low concentrations, while level variations can be used for diagnostic purposes. Quantitative determination of steroid hormones by liquid chromatography-mass spectrometry raises new perspectives in the study of hormone-dependent malignancies. The goal of this study was 2-fold: first to develop and validate an LC-MS method for the simultaneous quantification of androsterone glucuronide (ADTG), androstane-3α, 17β-diol-17glucuronide (3α-diol-17G), dehydroepiandrosterone sulfate (DHEAS), androstenedione (A4) and estrone sulfate (E1S), and second and equally important, to apply the method in the study of breast cancer. A simple and efficient fit-for-purpose method for the simultaneous quantification of the five hormones in human plasma was developed and validated. The presented method permits omission of derivatization and requires a single solid-phase extraction (SPE) procedure while the chromatographic separation can be achieved on a single C18 analytical column for all five analytes. The validated method was successfully applied for the analysis of 191 human plasma samples from postmenopausal women, which were divided into four groups according to the diagnosis of the breast lesion: benign breast disease (BBD), lobular neoplasia (LN), ductal carcinoma in situ (DCIS) and invasive ductal carcinoma (IDC).To the best of our knowledge, this is the first multi-analyte study evaluating the levels of all five hormones in patients with different histological types of breast diseases, which reflect different evolutionary stages of breast cancer. Significantly higher DHEAS plasma levels were observed in LN patients compared to IDC and BBD patients (p<0.05). LN patients also exhibited higher levels of DHEAS compared to DCIS patients, nevertheless the difference was marginally significant (p=0.057). Additionally, ADTG levels were significantly higher in patients with LN compared to those with BBD (p<0.05). Potential correlations of ADTG, 3a-diol-17G, DHEAS, A4 and E1S levels with conventional tumor markers (CEA, CA 15-3, Her/2-neu) levels and with anthropometric and epidemiologic characteristics of the patients, were also investigated.The results of the study are of particular interest for lobular neoplasia as it is recognized as a non-obligate precursor of invasive breast cancer and as a marker of increased risk for subsequent breast carcinoma development. Lobular neoplastic lesions are clinically occult and often mammographically silent. Thus, their differential diagnosis from other breast lesions is of crucial importance for the monitoring of patients and for selecting the appropriate treatment. The findings of the study support the potential application of ADTG and DHEAS quantitative analysis by LC-MS in the differential diagnosis of breast diseases. Prospectively, these two steroid hormones could be considered for inclusion in a breast cancer risk prediction model. Their inclusion could reinforce the valuable contribution of these models in the identification of women, which are in a greater risk and in need of a through diagnostic control and of intense systematic monitoring.

Οι στεροειδείς ορμόνες επηρεάζουν σημαντικές βιολογικές λειτουργίες και παίζουν καίριο ρόλο στην καρκινογένεση στο μαστό. Πρόκειται για ισχυρά μόρια, τα οποία ασκούν σημαντικές επιδράσεις ακόμα και σε χαμηλές συγκεντρώσεις, ενώ οι μεταβολές στα επίπεδα τους μπορούν να χρησιμοποιηθούν για διαγνωστικούς σκοπούς. Ο ποσοτικός προσδιορισμός των στεροειδών ορμονών με υγρή χρωματογραφία-φασματομετρία μαζών (LC-MS) δημιουργεί νέες προοπτικές στη μελέτη των ορμονοευαίσθητων κακοηθειών. Ο σκοπός αυτής της μελέτης ήταν διττός. Πρώτον, η ανάπτυξη και επικύρωση μεθόδου LC-MS για την ταυτόγχρονη ποσοτικοποίηση του γλυκουρονιδίου της ανδροστερόνης (ADTG), του ανδροσταν-3α, 17β-διολ-17-γλυκουρονιδίου (3α-diol-17G), της θειϊκής δεϋδροεπιανδροστερόνης (DHEAS), της ανδροστενδιόνης (A4) και της θειϊκής οιστρόνης (E1S). Δεύτερον και εξίσου σημαντικό, ήταν η εφαρμογή της αναπτυχθείσας μεθόδου στη μελέτη του καρκίνου του μαστού. Πραγματοποιήθηκε ανάπτυξη και επικύρωση μιας απλής και αποδοτικής μεθόδου LC-MS για τον ταυτόχρονο ποσοτικό προσδιορισμό και των πέντε ορμονών σε ένα δείγμα πλάσματος. Η μέθοδος περιλαμβάνει μια ενιαία κατεργασία δείγματος, για το σύνολο των ορμονών, με απαλοιφή της παραγωγοποίησης, ενώ ο χρωματογραφικός διαχωρισμός πραγματοποιείται σε μια C18 αναλυτική στήλη. Η μέθοδος εφαρμόστηκε με επιτυχία στην ανάλυση 191 δειγμάτων πλάσματος μετεμμηνοπαυσιακών γυναικών, οι οποίες καταχωρήθηκαν σύμφωνα με τη διάγνωση σε τέσσερις ομάδες: καλοήθη νόσο του μαστού (BBD), λοβιακή νεοπλασία (LN), πορογενές καρκίνωμα in situ (DCIS) και διηθητικό πορογενές καρκίνωμα (IDC). Η παρούσα, είναι η πρώτη μελέτη συνδυαστικής ανάλυσης και σύγκρισης των επιπέδων των πέντε ορμονών σε ασθενείς με παθήσεις του μαστού διαφορετικού ιστολογικού τύπου, οι οποίες αντικατοπτρίζουν διαφορετικά εξελικτικά στάδια του καρκίνου του μαστού. Σημαντικά υψηλότερα επίπεδα DHEAS παρατηρήθηκαν στο πλάσμα των ασθενών με LN έναντι των ασθενών με IDC και BBD (p<0,05). Οι ασθενείς με LN εμφάνισαν υψηλότερα επίπεδα DHEAS και έναντι των ασθενών με DCIS, αν και η διαφορά ήταν οριακά στατιστικά σημαντική (p=0,057). Επιπρόσθετα, τα επίπεδα του ADTG βρέθηκαν να είναι σημαντικά υψηλότερα στις ασθενείς με LN σε σύγκριση με τις γυναίκες με BBD (p<0,05). Διερευνήθηκε επίσης η συσχέτιση μεταξύ των επιπέδων των ADTG, 3α-diol-17G, DHEAS, A4 και E1S με τα επίπεδα καθιερωμένων καρκινικών δεικτών (CEA, CA 15-3, Her/2-neu) καθώς και με επιλεγμένα ανθρωπομετρικά και επιδημιολογικά στοιχεία των ασθενών. Τα αποτελέσματα της μελέτης παρουσιάζουν ιδιαίτερο ενδιαφέρον για τη λοβιακή νεοπλασία, η οποία θεωρείται εκτός από πρόδρομη αλλοίωση και δείκτης αυξημένου κινδύνου για επακόλουθη ανάπτυξη καρκίνου στο μαστό. Οι LN αλλοιώσεις είναι κλινικά απόκρυφες και συνήθως μαστογραφικά σιωπηλές. Η διαφοροδιάγνωση τους είναι εξαιρετικά σημαντική όχι μόνον για την παρακολούθηση των ασθενών αλλά και για τη χορήγηση κατάλληλης θεραπείας. Τα ευρήματα της μελέτης υποστηρίζουν ότι η ποσοτική ανάλυση των ADTG και DHEAS με την εφαρμογή της LC-MS, μπορεί να αποτελέσει ένα ωφέλιμο εργαλείο στη διαφορική διάγνωση των παθήσεων του μαστού. Προοπτικά, οι δυο αυτές ορμόνες θα μπορούσαν να συμπεριληφθούν σε ένα μοντέλο πρόβλεψης εμφάνισης της νόσου. Η ένταξη τους, θα μπορούσε να ενισχύσει την πολύτιμη συνεισφορά των μοντέλων στην ταυτοποίηση γυναικών, οι οποίες ευρίσκονται σε μεγαλύτερο κίνδυνο και χρήζουν πληρέστερου διαγνωστικού ελέγχου και συστηματικής παρακολούθησης.