Αλληλεπίδραση μεταξύ φυσικής και ειδικής ανοσίας στο επίπεδο των Toll-like και TCR υποδοχέων, σε λοιμώξεις από παράσιτα του γένους Leishmania

Abstract

Th1 immune responses contribute to the development of a protective immunity against Leishmania species. Over the past years, several Leishmania recombinant antigens have been identified and demonstrated to be potential candidates for use in experimental vaccines against leishmaniasis, since they induce the desired Th1 immune response. Eukaryotic initiation factors of Leishmania spp. (LeIF), are highly conserved proteins among Leishmania species and studies with eIF proteins from L. braziliensis and L. major, revealed the capacity of these molecules to induce effective protection in murine models of disease. In the present study, it was demonstrated for the first time the protective and/or immunotherapeutic activity of the eukaryotic initiation factor from L. infantum (LieIF), in an in vitro system of L. donovani-infected macrophages. It was also determined the mechanisms activated by macrophages in order to suppress the intracellular multiplication of the parasite, thus was confirmed that the leishmanicidal effect of LieIF was mediated by the production of antimicrobial agents such as NO and ROS. This protective effect of LieIF was associated with the activation of a TNF-α-dependent pathway and the production of the protective IL-12 cytokine. In contrary, the corresponding output of antimicrobial molecules induced by the immunotherapeutic activity of LieIF, proved not to be regulated by mechanisms that involve TNF-α production. Then, the immunomodulatory properties of LieIF were studied in an in vitro system of myeloid dendritic cells (DCs), by determining maturation and functional differentiation of these cells, as well as its synergy with the Toll-like receptors (TLRs). Confirmation of amplification of the immunomodulatory properties of LieIF, in synergy with the TLRs, enhances the future perspectives of exploiting this protein in various experimental protocols of immunotherapy with enhanced therapeutic effect. Following the methodology of reverse vaccinology, an in silico analysis of LieIF was performed, in order to identify short peptides that are recognized by T cell receptors (TCR) and have immunogenic properties. The in silico analysis of proteins with the use of epitope prediction algorithms, accelerates the process of finding antigenic epitopes and amplifies the use of these peptides as promising synthetic vaccine candidates. Synthetic peptides derived from such process and larger overlapping recombinant protein fragments of LieIF, were further tested for their immunomodulatory properties in in vitro systems, including macrophages and dendritic cells. The results showed for the first time, the existence of polyepitopic fragments of the protein with potent immunomodulatory properties. The data obtained by the in vitro studies, led to the evaluation of the in vivo activity of LieIF in experimental models of susceptible mice. Specifically, it was studied the effect of LieIF as adjuvant as well as the use of the recombinant protein in experimental protocols of immunotherapy and of protective vaccination against the disease. In brief, the obtained data showed that LieIF acts as adjuvant that is capable to induce adaptive immunity, as well as a strong immunomodulator in in vitro and in vivo experimental systems. This effect has proved capable to direct the polarization towards a Th1-mediated immune response. These findings provide a better understanding of the role of this cytoplasmic protein of the parasite, showing its potential for exploitation in effective strategies for disease control.

Οι Th1 ανοσολογικές αποκρίσεις συμβάλλουν στην ανάπτυξη προστατευτικής ανοσίας έναντι της λεϊσμανίασης. Τα τελευταία χρόνια, έχουν προσδιοριστεί διάφορα ανασυνδυασμένα αντιγόνα του παρασίτου Leishmania spp., τα οποία επέδειξαν ικανότητα επαγωγής Th1 ανοσολογικής απόκρισης και συνεπώς, υποσχόμενη δυναμική για την κατασκευή αποτελεσματικού εμβολίου έναντι της λεϊσμανίασης. Οι ευκαρυωτικοί παράγοντες έναρξης eIF του παρασίτου Leishmania spp. (LeIF), αποτελούν υψηλά συντηρημένες πρωτεΐνες και μελέτες αναφέρουν πως οι ευκαρυωτικοί παράγοντες έναρξης των στελεχών L. braziliensis και L. major, επάγουν αποτελεσματική προστασία έναντι της λεϊσμανίασης, σε πειραματικά μοντέλα ποντικών. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή, διερευνήθηκε η αντιλεϊσμανιακή δράση του ευκαρυωτικού παράγοντα έναρξης του στελέχους L. infantum (LieIF) και αποδείχθηκε για πρώτη φορά η προστατευτική ή/και ανοσοθεραπευτική δράση της πρωτεΐνης, σε in vitro σύστημα L. donovani-μολυσμένων μακροφάγων. Επίσης, προσδιορίστηκαν οι δραστικοί μηχανισμοί που επιστρατεύουν τα μακροφάγα ώστε να καταστείλουν τον πολλαπλασιασμό του παρασίτου και επιβεβαιώθηκε πως η λεϊσμανιοκτόνος δράση της LieIF, διαμεσολαβείται από την παραγωγή των παραγόντων NO και ROS. Αυτή η προστατευτική δράση της LieIF συσχετίστηκε με την ενεργοποίηση ενός TNF-α εξαρτώμενου μονοπατιού καθώς και με την παραγωγή της κυτταροκίνης IL-12. Αντιθέτως, η αντίστοιχη παραγωγή των αντιμικροβιακών μορίων, που προκλήθηκε από την ανοσοθεραπευτική δράση της LieIF, αποδείχθηκε πως δεν ρυθμίζεται από μηχανισμούς που περιλαμβάνουν τη συμμετοχή του TNF-α. Στη συνέχεια, μελετήθηκαν οι ανοσοτροποποιητικές ιδιότητες της LieIF, σε in vitro σύστημα μυελοειδών δενδριτικών κυττάρων (ΔΚ), τόσο σε επίπεδο ωρίμανσης και λειτουργικής διαφοροποίησης των κυττάρων, όσο και σε επίπεδο συνέργειας με τους υποδοχείς τύπου Toll (TLRs). Η επιβεβαίωση της ενίσχυσης των ανοσοτροποποιητικών ιδιοτήτων της ανασυνδυασμένης LieIF από τη συνεργιστική δράση των TLRs, ενισχύει τη μελλοντική χρήση της πρωτεΐνης σε πειραματικά πρωτόκολλα ανοσοθεραπείας με ενισχυμένο θεραπευτικό αποτέλεσμα. Επιπλέον, ακολουθώντας την μεθοδολογία της αντίστροφης πορείας σχεδιασμού εμβολίων (reverse vaccinology) πραγματοποιήθηκε in silico ανάλυση της LieIF, προκειμένου να προσδιοριστούν τα ελάχιστα δυνατά τμήματά της, που αναγνωρίζονται εν δυνάμει από τους ομόλογους υποδοχείς των Τ κυττάρων (TCR) και φέρουν ανοσογονικές ιδιότητες. Η in silico ανάλυση των πρωτεϊνών με τη χρήση αλγορίθμων πρόβλεψης αντιγονικότητας επιταχύνει τη διαδικασία εύρεσης αντιγονικών επιτόπων, ενισχύοντας την έρευνα που σχετίζεται με τον προσδιορισμό κατάλληλων πεπτιδίων για πρότυπα πρωτόκολλα συνθετικών εμβολίων. Τα συνθετικά πεπτίδια που προέκυψαν από την παραπάνω διαδικασία, καθώς και μεγαλύτερα αλληλοεπικαλυπτόμενα ανασυνδυασμένα πρωτεΐνικά τμήματα της LieIF, ελέγχθηκαν περαιτέρω, ως προς τις ανοσοτροποποιητικές τους ιδιότητες, σε in vitro συστήματα μακροφάγων και ΔΚ. Τα αποτελέσματα έδειξαν για πρώτη φορά, την ύπαρξη πολυεπιτοπικών τμημάτων της πρωτεΐνης με ισχυρές ανοσοτροποποιητικές ιδιότητες. Τα in vitro αποτελέσματα οδήγησαν στην αξιολόγηση της in vivo δράσης της LieIF σε πειραματικά μοντέλα ευαίσθητων έναντι της λεϊσμανίασης, ποντικών. Ειδικότερα, μελετήθηκε η δράση της LieIF ως ανοσοενισχυτικό και αναπτύχθηκαν πειραματικά πρωτόκολλα ανοσοθεραπείας με διαλυτή πρωτεΐνη και πρωτόκολλα προστατευτικού εμβολιασμού με ανοσιακή μεταφορά δενδριτικών κυττάρων ως «οχήματα μεταφοράς» της LieIF. Συνοψίζοντας, η LieIF επέδειξε ιδιότητες και δραστικότητα ανοσοενισχυτικού, ικανού να προάγει προσαρμοστική ανοσία, καθώς και ισχυρές ανοσοτροποποιητικές ιδιότητες σε in vitro και in vivo συστήματα, που αποδείχθηκαν ικανές να προσανατολίσουν την πόλωση μιας Th1-διαμεσολαβούμενης ανοσολογικής απόκρισης. Τα ευρήματα της μελέτης αυτής προσφέρουν πληρέστερη κατανόηση του ρόλου αυτής της κυτταροπλασματικής πρωτεΐνης του παρασίτου, αναδεικνύοντας τη μελλοντική της εκμετάλλευση στη στρατηγική ενός αποτελεσματικού ελέγχου της νόσου.