In vitro μελέτες διαπερατότητας φαρμάκων από εντερικά περιεχόμενα και προσομοιωμένα εντερικά περιεχόμενα

Abstract

Two were the objectives of this study. The first was to investigate how lipid structuresthat are present in intestinal fluids affect the transport of a lipophilic molecule to theintestinal epithelium and the flux through the epithelial cells. The second was toinvestigate how the intraluminal micellar phase in the fasted and in the fed stateaffects the permeability coefficient of molecules with various physicochemicalcharacteristics and mechanisms of transport through the intestinal epithelium.To achieve the first objective, one dose of the lipophilic model molecule, danazol,was dissolved in the lipid phase of a meal that was administered to healthy adults.Samples of intestinal contents were aspirated from the end of duodenum. Part of theseaspirates was ultracentrifugated, so that their micellar phases were obtained. Aspiratesand their micellar phases were used in permeability experiments with Caco-2 cellmonolayers (after appropriate dilution with buffer) and with the PAMPA technique.Το achieve the second objective, fluids simulating the micellar phase of the intestinalfluids in the fasted and in the fed state were used in permeability experiments usingsix model molecules. Again, Caco-2 cell lines and the PAMPA technique were used.The simulated intestinal fluids used in the Caco-2 experiments were developed in thisstudy.Regarding the first objective, experiments with both techniques showed that estimatedvalues of the permeability coefficients were higher when micellar phases were used.However, calculated flux of danazol was similar or bigger for the aspirates. Thismeans that after administration of the dose dissolved in the lipid phase, theintraluminal lipid structures play an important role on the absorption of the lipophilicmolecule danazol. Regarding the second objective, the permeability coefficient for thelipohilic molecules was smaller when using fluid simulating the fasted stateconditions compared to simple aqueous transport medium and even smaller whenusing fluid simulating the fed state conditions. This trend was more obvious inexperiments with Caco-2 cell lines. The composition of the transport medium did notplay a role on the permeability of hydrophilic molecules. The composition of thesimulated intestinal fluids affects the free fraction of lipophilic molecules, whereas itdoes not change the free fraction of hydrophilic molecules.

Η παρούσα διατριβή είχε σκοπό να απαντήσει σε δύο ερωτήµατα. Το πρώτο ήταν πώςλιπιδικές δοµές που υπάρχουν στα εντερικά περιεχόµενα επηρεάζουν την πρόσβασηενός λιπόφιλου µικροµορίου στο εντερικό επιθήλιο και τη ροή του µέσω τωνεπιθηλιακών κυττάρων. Το δεύτερο ερώτηµα ήταν πώς επηρεάζεται η τιµή τουσυντελεστή διαπερατότητας µικροµορίων µε ποικίλα φυσικοχηµικά χαρακτηριστικάκαι µηχανισµούς µεταφοράς µέσω του εντερικού επιθηλίου από τις συνθήκες πουεπικρατούν στη µικκυλιακή φάση των ενδοαυλικών περιεχοµένων κατά τηδιαπεπτική περίοδο και κατά τη διάρκεια της πέψης.Για να απαντηθεί το πρώτο ερώτηµα χρησιµοποιήθηκαν δείγµατα εντερικώνπεριεχοµένων από υγιείς εθελοντές, στους οποίους είχε χορηγηθεί γεύµα που περιείχεµια δόση δαναζόλης διαλυµένη στη λιπιδική του φάση. Μέρος κάθε δείγµατοςυπερφυγοκεντρήθηκε και ελήφθη η µικκυλιακή τους φάση, που περιείχε κυρίως µικτάµικκύλια. Τα εντερικά περιεχόµενα και οι µικκυλιακές τους φάσειςχρησιµοποιήθηκαν σε πειράµατα διαπερατότητας µε την τεχνική PAMPA και, µετάαπό κατάλληλη αραίωση, µε χρήση Caco-2 κυτταρικών µονοστιβάδων. Για τηδιερεύνηση του δεύτερου ερωτήµατος, χρησιµοποιήθηκαν µέσα που προσοµοιώνουντη µικκυλιακή φάση κατά τη διαπεπτική περίοδο και την περίοδο πέψης καιµελετήθηκε η διαπερατότητα έξι µικροµορίων µε την τεχνική PAMPA και µε χρήσηCaco-2 κυτταρικών µονοστιβάδων. Τα προσοµοιωµένα εντερικά υγρά πουχρησιµοποιήθηκαν στα πειράµατα µε χρήση Caco-2 κυτταρικών µονοστιβάδωναναπτύχθηκαν στα πλαίσια της παρούσας µελέτης.Όσον αφορά στο πρώτο ερώτηµα, τα πειράµατα και µε τις δύο τεχνικές έδειξαν ότι οισυντελεστές διαπερατότητας ήταν γενικά µεγαλύτεροι όταν χρησιµοποιήθηκε ηµικκυλιακή φάση σε σχέση µε τα εντερικά περιεχόµενα. Η ροή µεταφοράς τηςδαναζόλης µέσω του εντερικού επιθηλίου ήταν όµως παρόµοια ή µεγαλύτερη από ταεντερικά περιεχόµενα. Αυτό σηµαίνει ότι οι λιπιδικές δοµές που δηµιουργούνταιενδοαυλικά παίζουν σηµαντικό ρόλο στην απορρόφηση της λιπόφιλης δαναζόληςµετά από χορήγησή της σε λιπιδική φάση. Η απάντηση στο δεύτερο ερώτηµα ήτανότι ο συντελεστής διαπερατότητας για λιπόφιλα µόρια είναι µικρότεροςχρησιµοποιώντας µέσο που προσοµοιώνει τη µικκυλιακή φάση κατά τη διαπεπτική περίοδο από ότι απλό υδατικό µέσο µεταφοράς (που κατά κανόνα χρησιµοποιείταισήµερα σε σχετικές µελέτες) και ακόµα µικρότερος χρησιµοποιώντας µέσο πουπροσοµοιώνει τη µικκυλιακή φάση κατά την περίοδο πέψης. Η τάση αυτή ήτανπερισσότερο εµφανής στα πειράµατα µε τις Caco-2 κυτταρικές µονοστιβάδες. Γιαυδρόφιλα µόρια η σύσταση του µέσου µεταφοράς δεν παίζει ρόλο στηδιαπερατότητα. Για τα λιπόφιλα µόρια η διαφορετική σύσταση των προσοµοιωµένωνεντερικών περιεχοµένων αλλάζει το ελεύθερο κλάσµα, ενώ στα υδρόφιλα µόρια τοελεύθερο κλάσµα είναι συνέχεια ίδιο.