Molecular inflammatory factors in diabetic retinopathy: role of azurocidin

Abstract

PURPOSE. Azurocidin, released by neutrophils during leukocyte-endothelial interaction, is a main cause of leukocyte-evoked vascular leakage. Its role in the retina, however, is unknown.METHODS. Brown Norway rats received intravitreal injections of azurocidin and vehicle control. Blood-retinal barrier (BRB) breakdown was quantified using the Evans blue (EB) dye technique 1, 3, and 24 hours after intravitreal injection. To block azurocidin, aprotinin was injected intravenously before the intravitreal injections. To investigate if azurocidin increases retinal leukostasis, number of adherent leukocytes in the retina 2 hours and 24 hours after azurocidin injection were quantified using the Concanavalin A perfusion technique. To investigate whether azurocidin plays a role in vascular endothelial growth factor (VEGF)-induced BRB breakdown, rats were treated intravenously with aprotinin, followed by intravitreal injection of VEGF164. BRB breakdown was quantified 24 hours later. To investigate whether azurocidin may mediate BRB breakdown in early diabetes, aprotinin or vehicle was injected intravenously each day for 10 days to streptozotocin-induced diabetic rats, and BRB breakdown was quantified. To investigate whether azurocidin may mediate BRB breakdown in endotoxin induced uveitis (EIU) as another model of leukocyte mediated retinal vascular leakage , EIU rats were treated with aprotinin or vehicle and BRB breakdown was quantified 24 hours after the EIU induction.RESULTS. Intravitreal injection of azurocidin (20 μg) induced a 6.8-fold increase in vascular permeability compared with control at 1–3 hours (P < 0.05), a 2.7-fold increase at 3-5 hours (P < 0.01), and a 1.7-fold increase at 24 hours (P < 0.05). Azurocidin did not increase static retinal leukostasis at 2 hours after the intravitreal injection or 24 hours after the intravitreal injection. Aprotinin inhibited azurocidin-induced BRB breakdown by 98% (P < 0.05). Furthermore, treatment with aprotinin significantly suppressed VEGF-induced BRB breakdown by 93% (P < 0.05) , BRB breakdown in early experimental diabetes by 40.6% (P < 0.05) and BRB breakdown in EIU by 73% (P<0.05)CONCLUSIONS. Azurocidin increases retinal vascular permeability and is effectively blocked by aprotinin. The inhibition of VEGF-induced, early diabetic BRB breakdown and EIU retinal vascular leakage with aprotinin indicates that azurocidin may be an important mediator of leukocyte-dependent BRB breakdown especially in a disease model like diabetes that leukostasis is crucial in pathogenesis. Azurocidin may become a new therapeutic target in the treatment of retinal vascular leakage, diabetic retinopathy and diabetic macular edema.

ΣΚΟΠΟΣ.Η Azurocidin, μετά την εκκρισή της από τα ουδετερόφιλα λευκοκύτταρα κατα την διάρκεια της αλληλεπίδρασης λευκοκυττάρων -αγγειακών ενδοθηλιακών κυτταρων είναι η κύρια αιτία αυξημένης αγγειακής διαπερατότητας σαν αποτέλεσμα της προσκόλλησης των λευκοκυττάρων. Ο ρόλος της στον αμφιβληστροειδή, όμως, παραμένει άγνωστος.ΜΕΘΟΔΟΙ. Η azurocidin δόθηκε με ενδουαλοειδικές ενέσεις σε Brown Norway αρουραίους. Η ποσοτικοποίηση της ρήξης του αιματο-αμφιβληστροειδικού φραγμού (ΑΑΦ) έγινε με την τεχνική Evans Blue (EB) 1, 3, and 24 ώρες μετά την ενδουαλοειδική ένεση. Για να μελετήσουμε αν η azurocidin προκαλεί αυξημένη προσκόλληση λευκοκυττάρων στα αγγεία του αμφιβληστροειδή, ο αριθμός των προσκολλημένων λευκοκυττάρων μετρήθηκε με την μέθοδο της Concanavalin A 2 ώρες και 24 ώρες μετά την ενδουαλοειδική ένεση με azurocidin. Για την απενεργοποίηση της azurocidin, απροτινίνη δόθηκε ενδοφλέβια πριν την ενδουαλοειδική ένεση της azurocidin. Για να μελετήσουμε αν η azurocidin παίζει ρόλο στην ρήξη του ΑΑΦ που προκαλει ο αγγειακός αυξητικός ενδοθηλιακός παράγοντας (vascular endothelial growth factor-VEGF), οι αρουραίοι παρέλαβαν ενδοφλέβια θεραπεία με απροτινίνη και το VEGF δώθηκε ενδουαλοειδικά και η ρήξη του ΑΑΦ ποσοτικοποιήθηκε 24 ώρες αργότερα. Για να μελετήσουμε αν η azurocidin παίζει ρόλο στην ρήξη του ΑΑΦ στα αρχικά στάδια του διαβήτη, απροτινίνη δωθηκε ενδοφλέβια καθημερινά για 10 μέρες σε αρουραίους που είχαν γίνει διαβητικοί με ενδοπεριτοναική ένεση streptozotocin και η ρήξη του ΑΑΦ μετρήθηκε 2 εβδομάδες μετά την έναρξη του διαβήτη. Για να μελετήσουμε αν η azurocidin παιζει ρόλο στην ρήξη του ΑΑΦ στην ραγοειδίτιδα λόγω ενδοτοξίνης (endotoxin induced uveitis, EIU) ως μοντέλο ρήξης του ΑΑΦ με την μεσολάβηση προσκόλλημένων λευκοκυττάρων, θεραπεία με απροτινίνη δωθηκε σε αρουραιους με πειραματική ραγοειδιτιδα EIU και η ρήξη του ΑΑΦ μετρήθηκε 24 ώρες μετά την έναρξη της ραγοειδίτιδας. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ. Ενδουαλοειδική ένεση azurocidin (20 μg) αύξησε την αγγειακή διαπερατότητα του αμφιβληστροειδούς κατα 6.8 φορές σε σύγκριση με την ομάδα ελέγχου 1-3 ώρες μετά την ένεση (P < 0.05), κατά 2.7-φορές στις 3-5 ώρες (P < 0.01) και κατά 1.7 φορές στις 24 ώρες (P < 0.05). H azurocidin δεν αύξησε τον αριθμό προσκολλημένων λευκοκυττάρων στα αγγεία του αμφιβληστροειδή 2 ώρες και 24 ώρες μετά την ενδουαολειδίκη ένεση. Η απροτινίνη ανέστειλε την αύξηση της διαπερατότητας μετά απο την ενδαυαλοειδική ένεση της azurocidin κατα 98% (P < 0.05). Επίσης , η απροτινίνη ανέστειλε την ρήξη του ΑΑΦ μετά απο την ενδoυαλοειδική ένεση VEGF κατα 93% (P < 0.05), μείωσε την ρήξη του ΑΑΦ σε διαβητικούς αρουραίους κατά 40.6% (P < 0.05) και μειώσε την αγγειακή διαπερατότητα του αμφιβληστροειδούς στην πειραματική ραγοειδίτιδα κατα 73% (P<0.05). ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ. Η αzurocidin αυξάνει την αγγειακή διαπερατότητα του αμφιβληστροειδή και η απροτινίνη ειναι αποτελεσματικός αναστολέας της δράσης της αzurocidin στην διαπερατότητα των αγγείων του αμφιβληστροειδή. Η αναστολή της ρήξης του ΑΑΦ με την απροτινίνη στο μοντέλο διαβητικής αμφιβληστροειδοπάθειας, μετά απο ένεση VEGF και στο μοντέλο ραγοειδίτιδας είναι ένδειξη πως η azurocidin είναι πιθανό να έχει σημαντικό ρόλο στην ρήξη του ΑΑΦ μέσω προσκόλλησης λευκοκυττάρων στα αγγειακά ενδοθηλιακά κύτταρα ειδικά στον διαβήτη όπου η προσκόλληση των λευκοκυττάρων εινια κρίσιμη στην παθογένεση του διαβητικού οιδήματος της ωχράς. Η αzurocidin μπορεί να αποτέλεσει ένα καινούριο θεραπευτικό στόχο για την διαβητική αμφιβληστροεδοπάθεια και το διαβητικό οίδημα της ωχράς.