Ο ρόλος των δορυφόρων κυττάρων στη δυναμική της αναγέννησης μυϊκού ιστού, κατόπιν μυοτοξικού τραυματισμού

Abstract

INTRODUCTION. Mauro (1961) introduced the term "Satellite cell" to describe a mononucleated cell lying between the plasma membrane and basal lamina of muscle cell. After muscle injury Satellite cells become activated, proliferate and eventually fuse to form regenerate muscle fibres. Study the regeneration procedure (activation, duration, differentiation) is crucial in Athletic Science as the derived information, concerning Satellite cells behaviour, could be used to form training recovery programmes in injured athletes. In addition, data could be applicable on physical therapy practice as well as on other research area referred to Satellite cells, i.e. myopathology. The aim of the present work was a) to study the ultrastructure of muscle regeneration events, b) to describe the molecular events of RNA motility and c) to estimate the immunohistochemical expression of Desmin, Vimentin and Merosin. METHODS. 21 young male Wistar rats were used. In the left Soleus muscle was injected 1ml BPVC of 0.5% and the right control leg received saline. The days 1,2,3,5,7,14,21 the soleus muscles were taken, 3 animals/day. For the light microscope sections of 1µm stained with Toluidine Blue were used. For the electron microscope examination sections of 50-90 nm double stained with Lead citrate and Uranyl acetate were used. Acridine orange staining was applied for the Fluorescent microscope. In the immunohistocemical studies were used the Desmin, Vimentin and Merosin antibodies. RESULTS. Ultrastructural studies: Following trauma a brisk inflammatory response was observed and the necrotized material was phagocytosed in days 1,2. On day 3 satellite cells were proliferated and differentiated into myoblasts of different shapes. On day 5 myoblasts were fused in multinucleated myotubes and muscle fibers sprouts were observed on day 7. On 14 and 21 day appeared young fibers of small diameter. Fluorescence: Positive RNA fields of intense red-orange reaction were observed on days 3,5,7. Immunohistochemistry: Merosin antibody was positive for all the biopsy days. Vimentin reactivitywas intense on 3,5,7 days whereas Desmin antibody reactivity on days 5,7. DISCUSSION. Injury activates the quiescent Satellite cell to enter the mitotic cycle, proliferate into myoblasts, fuseinto myotubes and finally differentiate. Except for the Satellite cells, other cell types (inflammatory,fibroblasts) influence the regeneration final result. Heterogeneity on the sequence of ultrastructureevents into the fibers was observed. Different fluorescent colors revealed different quality andquantity of ribosomal muscle content. Vimentin topography coincided with that of Acridine orange.

ΕΙΣΑΓΩΓΗ. Ο Mauro το 1961 εισήγαγε τον όρο ∆ορυφόρο κύτταρο για να περιγράψει "ένα µονοπύρηνο κύτταρο που κείτεται εκατέρωθεν της Βασικής και της Πλασµατικής µεµβράνης". Φαίνεται ότι τα ∆ορυφόρα κύτταρα αποτελούν τον κεντρικό παράγοντα ενεργοποίησης για την επαναδόµηση του τραυµατισµένου µυϊκού ιστού. Η πρακτική σπουδαιότητα διερεύνησης της αναγεννησιακής διαδικασίας (χρόνος έναρξης, διάρκεια, περάτωση) είναι επιτακτική στο χώρο της Αθλητικής Επιστήµης, καθώς οι πληροφορίες µπορούν να εφαρµοστούν στη συνταγογράφηση προπονητικών προγραµµάτων αποκατάστασης τραυµατισµένων αθλητών στον ευρύτερο χώρο της Φυσικής Αγωγής και Αθλητισµού. Επίσης, τα µικροσκοπικά δεδοµένα που αφορούν τη διαδικασία της αναγέννησης, µπορούν να καθοδηγήσουν φυσικοθεραπευτικές παρεµβάσεις ώστε να συµβαδίζουν µε την εγγενή προσπάθεια του µυός για αποκατάσταση. Οι παρατηρήσεις της συµπεριφοράς των ∆ορυφόρων κυττάρων µπορούν να αξιοποιηθούν και από τα άλλα διαθεµατικά πεδία παρουσίας των ∆ορυφόρων κυττάρων όπως µυϊκή προσαρµογή (υπερτροφία), µυοπαθολογία, µυογένεση. Σκοπός της µελέτης ήταν α) να µελετηθούν τα µορφολογικά-ιστολογικά γεγονότα της αναγεννησιακής διαδικασίας β) να περιγραφούν τα µοριακά γεγονότα της κινητικότητας RNA µε τη χρήση φθορισµού και γ) να εκτιµηθεί η έκφραση των δεικτών ∆εσµίνης και Βιµεντίνης σε όλες τις φάσεις αναγέννησης και η διατήρηση της βασικής µεµβράνης του µυϊκού ιστού (Μεροσίνη). ΜΕΘΟ∆ΟΣ. Το δείγµα αποτελείται από 21 αρσενικούς επίµυες Wistar ηλικίας 3-3.5 µηνών. Χρησιµοποιήθηκε τοµυοτοξικό µοντέλο Μαρκαϊνης που µιµείται τα γεγονότα του τραυµατισµού κατά την προπόνηση. Στο αριστερό πειραµατικό πόδι έγινε έκχυση 1 ml Μαρκαϊνης 0.5% κατά µήκος του επιµήκη άξονα του υποκνηµίδιου µυός, ενώ στο δεξί πόδι ελέγχου έγινε έκχυση ορού. Τις ηµέρες 1,2,3,5,7,14,21πραγµατοποιήθηκε εκτοµή του υποκνηµίδιου µυός ( 3 επίµυες/ηµέρα) µε ταυτόχρονη θυσία τωνπειραµατόζωων. Τοµές πάχους 1µm χρώστηκαν µε Κυανούν της τολουϊδίνης και εξετάστηκαν στοοπτικό µικροσκόπιο. Τοµές πάχους 50-90 nm χρώστηκαν µε οξικό ουρανύλιο και κιτρικό µόλυβδοκαι εξετάστηκαν στο ηλεκτρονικό µικροσκόπιο. Με τη χρώση Πορτοκαλόχρουν της ακριδίνης ταδείγµατα εξετάστηκαν στο µικροσκόπιο φθορισµού. Εφαρµόστηκαν ανοσοϊστοχηµικές τεχνικές µε τααντισώµατα ∆εσµίνης, Βιµεντίνης, Μεροσίνης. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ. Ηλεκτρονικό µικροσκόπιο: Ο τραυµατισµένος ιστός υπόκεινται σε φλεγµονώδη αντίδραση τις ηµέρες 1,2 µε έντονη δραστηριότητα λευκοκυτταρικών τύπων και έναρξη της φαγοκυττάρωσης για την αποµάκρυνση του νεκρωτικού υλικού. ∆ιατάραξη της αρχιτεκτονικής δοµής των σαρκοµερίων. Την 3 ηµέρα εντοπίστηκαν ενεργοποιηµένα µονοπύρηνα κύτταρα σε διαδικασία πολλαπλασιασµού. Την 5 ηµέρα οι µυοβλαστικές δοµές συντήχθηκαν σε πολυπύρηνα µυοσωληνάρια. Εντός των µυοσωλήνων στις περιφερειακές θέσεις παρατηρήθηκαν αρχόµενα κυµατοειδή µυοϊνίδια που οργανώνονται σε µυοδεµάτια από την 7 ηµέρα. Την 14 και 21 ηµέρα εµφανίστηκαν οι νεαρές ίνες µικρής διαµέτρουµε πυρήνες σε κεντρική θέση. Μικροσκόπιο φθορισµού: Θετικές RNA περιοχές έντονου πορτοκαλί- κόκκινου φθορισµού που αντιστοιχούν σε αυξηµένη πρωτεϊνοσύνθεση παρατηρήθηκαν τις ηµέρες 3,5,7 µε διαβάθµιση στην ένταση φθορισµού. Ανοσοϊστοχηµεία: Η έκφραση των ενδιάµεσων ινιδίων Βιµεντίνης κορυφώθηκε τις ηµέρες 3,5,7 και τις ∆εσµίνης τις ηµέρες 5,7. Το αντίσωµα της Μεροσίνης είχε θετική απάντηση για όλες τις ηµέρες βιοψιών. ΣΥΖΗΤΗΣΗ-ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ. Ο τραυµατισµός ενεργοποιεί τα ∆ορυφόρα κύτταρα που πολλαπλασιάζονται µε µιτωτικές διεργασίεςκαι συντήκονται σε πολυπύρηνα µυοσωληνάρια για να διαφοροποιηθούν σε µυϊκές ίνες. Η διαφορετική µορφολογία µυοβλάστης πιθανόν να υποδηλώνει διαφορετικούς πληθυσµούς ∆ορυφόρων κυττάρων. Χρονική ετερογένεια αναγέννησης εντός των ινών. ∆ιαφορετική ποιότητα καιποσότητα RNA τις ηµέρες 3,5,7. Συσχέτιση τοπογραφίας Βιµεντίνης και φθορισµού. Στη διαδικασίατης αναγέννησης εµπλέκονται πολλοί παράγοντες (φλεγµονώδη, ινοβλάστες) που ο καθέναςεναποθέτει τη δική του βαρύτητα στο τελικό αποτέλεσµα.