Μελέτη μηχανισμών δράσης της υδροξυουρίας σε συνδυασμό με άλλες κυτταροκίνες σε καλλιέργειες αρχέγονων αιμοποιητικών κυττάρων

Abstract

The pathophysiological role of fetal hemoglobin in thalassemia was described in the beginning of the 1960s, when various genetical and biochemical studies attributed the survival of patients suffering severe abnormalities in chain to the existence of HbF. Thus, it was made clear that abundant production of fetal hemoglobin can considerably improve the clinical picture of patients suffering from -thalassemia and sickle cell anemia. Hence various pharmaceutical substances were tested - first on animals and subsequently on patients - which led to the increase in fetal hemoglobin. Research focused on the study of pharmaceutical substances which induced fetalhemoglobin in order to look into the mechanisms of action (MOA) of the subjects. According to hitherto findings, the mechanisms of action (MOA) of various inductive to HbF substances are diverse and usually involve action in cell proliferation and cellular differentiation or directly in the transcription of globin gene, increasing the levels of ymRNA transcripts, as well as interaction between intercellular signals. On one hand, there is great interest in the study of the y globin gene molecular regulation mechanism and, on the other hand, in finding new pharmacology-relatedfactors that increase the production of HbF. The substances which increase HbF ensure the promotion of BFU-EF cells, which preserve the y globin chain production program, and the absence of normal BFU-E, at the same time. Bibliographical references pertaining to the participation of post-transcription and translation mechanisms in the expression of globin genes and the action of inductive to HbF substances are limited. The aim of this study is to focus on the hydroxyurea mechanism of action to induce fetal hemoglobin, used either alone or in combination with cytokines, erythropoietin and SCF in a transcription, post-transcription and translation level. The primary CD34+ cell cultures of adult peripheral blood compose the study system which allows cellular differentiation towards erythroid lineage and excels all other culture systems so that the mechanism of action of HU and of its combination with Epo and SCF is studied. We observed the stages of the culture and the modification in the surface markers CD34, CD71, CD117 and glycophorin A (GPA), as well as the production of cells which compose HbF. The culture lasts 14 days. In this time-span, CD34 cells differentiate in mature erythroid cells expressing high levels of CD71 and glycophorin, low levels of CD117 and moderate levels of HbF. The increase in the concentration of erythropoietin (from 4 to 10 u/ml) affects cellular differentiation and leads to the increase in the expression ratio of GPA+, GPA+/HbF and F+ cells. The increase in GPA+cells and in the intracellular levels of expression of CD71 indicates faster development of the cells, rendering them possible to end updifferentiated. When the inductive factor (hydroxyurea-HU) is used in cultures, the number of cellswhich express HbF increases and remains higher than the number of control cells, even on the 14th day of the culture. However, the action of high concentration of Epo and HU in combination does not ensure any further increase in F+ cells numbers. SCF administration is important in the former stages of development of the culture of control cell for the proliferation and differentiation of the cells as well as for the production of HbF. As the differentiation of the cells is proceeding and the globin switching takes place, the number of F+ cells decreases. Nevertheless, we noticed thatretaining SCF in cells which conduct normal erythropoiesis (control cells) after the stage of proerythroblast results in the increase in the number of cells and in the decreased production of HbF, in comparison to the cells where the administration of SCF was ceased. On the contrary, retaining it in cells which conduct erythropoiesis under stress (they receive HU) results in a higher number of F+ cells, in comparison to the cells where the administration of SCF was ceased. It is thus proven that the path activated by the combination of SCF with the receptor of CD117 acts in cells that undergo stress erythropoiesis in an advanced stage of development, as it also occurs by using HU. Therefore, it is shown that SCF synergizes with HU in increasing F-cells. The co-existence of the factors mentioned above enhances cell proliferation, directly resulting in the reduction of their nutrient stores, which consequently leads to a delay of differentiation. The hemoglobin produced is measured with High Pressure Liquid Chromatography (HPLC) for chain analysis. After HU action and by retaining SCF after the stage of proerythroblast, we notice that the ratio Gy/Αγ increases, which triggers Gy globin chain; yet, the amount of the produced HbF is reduced until the 11th day of the culture, compared to the control cells, and increases on the 14th day. Finally, in cultures of mature erythroblasts with HU action, the number of F-cells increases and HbF is produced triggering Gy globin chain, if the administration of SCF continues. The increased production of HbF hemoglobin is noted on the 14th day of the culture. On the contrary, in cultures where SCF administration is ceased and HU is administrated after the stage of proerythroblast, cell differentiation is proceeding much faster. On the 12th day the cell increases HbF production levels to the ones it was before, because of HU action, but also triggers Gy globin chain, and on the 14th day the productiondecreases to the production levels of the control cells. Studying γ-mRNA transcripts, at the same time, we also observed that their production in the control cells increases from the 6th to the 8th day of culture, whereas on the 12th day their production decreases as their maturation has proceeded and the synthesis of βtranscripts has increased. The cells receiving ΙΟΟμΜ HU for one day, either continuously or pulse treatment increase the production levels of -mRNA transcripts on the 12th day of the culture. The production of HbF, as expressed by (γ/β+γ) transcripts ratio, increases with the action of ΙΟΟμΜ HU, by continuous or pulse treatment for one day, and is higher on the 8th day. Conversely, HU administration does not affect HbA (β/β+γ) whatsoever. Furthermore, we noticed that SCF action in mature erythroblasts and increase of the administrated Epo (from 4 to lOu/ml) results in modifications in β- and -mRNA transcripts. SCF administration increases the production ofY-mRNA transcripts. On the 6th day, this increase is small in the cells receiving HU, yet on the 12th day the production of -mRNA transcripts significantly increases in control cell with the action of both Epo concentrations (4 and ΙΟμΜ), as much as with HU action.It is clear that SCF and Epo are complementary to HU to produce -mRNA transcripts. Apart from the action in post-transcription level, the action of HU in the maturation of γmRNA transcripts was also remarked, since the interaction of HU with a transcription inhibitor, actinomycin D, contributes to the increase of -mRNA transcripts. Moreover, we did not witness action of any translation mechanism, since γ-mRNA transcripts induced by HU was not affected when the translation switched off by using cycloheximide. Further increase in the levels of -mRNA transcripts, by using HU and simultaneously adding CX as well as act-D, may be attributed to hydroxyurea action in the level of transcription and post-transcription maturation, as indicated by its action when thetranscription switches off for 24 hours, where the binding action of HU appears intense in -mRNA transcripts. The outcomes of this study provided crucial information about the mechanisms involvedin the action of hydroxyurea in globin genes, both with and without the presence of other cytokines, and significant data in order to study their interaction, too.

Στην αρχή του 1960, σε ποικίλες γενετικές και βιοχημικές μελέτες περιγράφηκε ο παθοφυσιολογικός ρόλος της εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης στη θαλασσαιμία. Η επιβίωση ασθενών με σοβαρές ανωμαλίες στη β αλυσίδα αποδόθηκε στην ύπαρξη HbF. Έγινε επομένως ξεκάθαρο ότι η παραγωγή σε αφθονία της εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης μπορεί να βοηθήσει σημαντικά την κλινική εικόνα ασθενών με β θαλασσαιμία και δρεπανοκυτταρική αναιμία. Για το λόγο αυτό χρησιμοποιήθηκαν διάφορες φαρμακευτικές ουσίες, αρχικά σε πειραματόζωα και ακολούθως σε ασθενείς, οι οποίες οδήγησαν σε αύξηση της εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης. Το επόμενο στάδιο των ερευνών κατευθύνθηκε στη μελέτη των φαρμακευτικών ουσιών που επάγουν την εμβρυϊκή αιμοσφαιρίνη με στόχο τη διερεύνηση των μηχανισμών δράσης των υποκειμένων. Με τα έως τώρα δεδομένα οι μηχανισμοί δράσης των διαφόρων επαγωγικών ουσιών της HbF ποικίλουν και συνήθως αφορούν επιδράσεις στον πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση των κυττάρων ή άμεσα στη μεταγραφή του γ γονιδίου, με αύξηση των επιπέδων των γ-μεταγράφων καθώς και αλληλεπίδραση ενδοκυτταρικών σημάτων. Ακόμη και σήμερα υπάρχει αμείωτο ενδιαφέρον αφενός μεν για τη μελέτη του μοριακού μηχανισμού ρύθμισης της έκφρασης του γ γονιδίου, αφετέρου για την εύρεση νέων φαρμακολογικών παραγόντων που αυξάνουν την παραγωγή της HbF. Οι ουσίες που αυξάνουν την HbF επιτυγχάνουν επιλεκτική προαγωγή των κυττάρων BFU-EF, τα οποία διατηρούν το πρόγραμμα παραγωγής γ αλυσίδων και παράλληλη απουσία των φυσιολογικών BFU-E. Οι βιβλιογραφικές αναφορές σχετικά με τη συμμετοχή μετα-μεταγραφικών και μεταφραστικών μηχανισμών στην έκφραση των γονιδίων σφαιρίνης και στη δράση επαγωγικών για την HbF ουσιών είναι περιορισμένες. Στην παρούσα μελέτη επικεντρωνόμαστε στη διερεύνηση του μηχανισμού δράσης της υδροξυουρίας στην επαγωγή της εμβρυϊκής αιμοσφαιρίνης, προστιθέμενη μόνη της ή και με παράλληλη χορήγηση κυτταροκινών, ερυθροποιητίνης και SCF σε επίπεδο μεταγραφικό, μετα-μεταγραφικό και μεταφραστικό. Οι πρωτογενείς καλλιέργειες CD34+ κυττάρων από περιφερικό αίμα ενηλίκων, αποτελεί το σύστημα μελέτης που επιτρέπει τη διαφοροποίηση των κυττάρων προς την ερυθρά σειρά και υπερτερεί των υπολοίπων συστημάτων καλλιέργειας προκειμένου να μελετηθεί ο μηχανισμός δράσης της HU και των συνδυασμών της με Ερο και SCF. Παρακολουθήσαμε την εξέλιξη της καλλιέργειας και τη μεταβολή των αντιγονικών δεικτών CD34, CD71, CD117, Γλυκοφορίνη A (GPA), καθώς και την παραγωγή κυττάρων που συνθέτουν HbF. Η συνολική διάρκεια της καλλιέργειας είναι 14 ημέρες. Σε αυτό το χρονικό διάστημα τα CD34+ κύτταρα διαφοροποιούνται σε ώριμα ερυθροειδικά κύτταρα με υψηλή έκφραση CD71 και γλυκοφορίνης, μειωμένη έκφραση CD117 και μέτρια επίπεδα HbF. Η αύξηση της συγκέντρωσης της ερυθροποιητίνης (από 4 σε IOu/πιΙ), επηρεάζει τη διαφοροποίηση των κυττάρων και οδηγεί σε αύξηση του ποσοστού έκφρασης των GPA+, GPA+/HbF+ και των F+ κυττάρων. Η αύξηση των GPA+ κυττάρων και των ενδοκυττάριων επιπέδων έκφρασης του CD71 υποδηλώνει ταχύτερη ωρίμανση των κυττάρων με δυνατότητα αυτών να οδηγηθούν σε τελική διαφοροποίηση. Με τη χρήση του επαγωγικού παράγοντα (υδροξυουρία-HU) στις καλλιέργειες αυξάνετε ο αριθμός των κυττάρων που εκφράζουν HbF και διατηρείται υψηλότερος αυτού των κυττάρων μαρτύρων, ακόμη και τη 14η ημέρα καλλιέργειας. Όμως τελικά συνδυασμένη δράση υψηλής συγκέντρωσης Ερο και HU δεν εξασφαλίζει περαιτέρω αύξηση του ποσοστού των F+ κυττάρων . Η παρουσία του SCF είναι απαραίτητη στα αρχικά στάδια ανάπτυξης της καλλιέργειας των κυττάρων μαρτύρων για τον πολλαπλασιασμό και τη διαφοροποίηση των κυττάρων καθώς και για την παραγωγή της HbF. Καθώς προχωρά η διαφοροποίηση των κυττάρων και πραγματοποιείται η μεταστροφή της αιμοσφαιρίνης, ελαττώνεται ο αριθμός των F+ κυττάρων. Παρατηρήσαμε όμως ότι η παραμονή του SCF στην καλλιέργεια μετά το στάδιο της προερυθροβλάστης σε κύτταρα που εκτελούν φυσιολογική ερυθροποίηση (κύτταρα μάρτυρες), έχει σαν αποτέλεσμα αύξηση του αριθμού των κυττάρων και την μειωμένη παραγωγή HbF+ σε σχέση με τα κύτταρα που σταματά η χορήγηση του. Αντιθέτως στα κύτταρα που εκτελούν ερυθροποίηση υπό stress (λαμβάνουν HU), η παραμονή του οδηγεί σε υψηλότερα ποσοστά F+ κυττάρων σε σχέση με τα κύτταρα όπου διακόπτεται η χορήγηση του. Αποδεικνύεται επομένως ότι το μονοπάτι που ενεργοποιείται με τη σύνδεση του SCF με τον υποδοχέα του CD117, δρα σε κύτταρα σε προχωρημένο στάδιο ανάπτυξης που υπόκεινται σε stress ερυθροποίηση, όπως συμβαίνει παρουσία της HU, γεγονός που σηματοδοτεί συνέργια μεταξύ του SCF και της HU προκειμένου για την αύξηση των F+ κυττάρων. Με τη συνύπαρξη αυτών των παραγόντων πριμοδοτείται ο πολλαπλασιασμός των κυττάρων, με άμεσο αποτέλεσμα την ελάττωση των θρεπτικών αποθεμάτων τους που με τη σειρά του οδηγεί σε καθυστέρηση της διαφοροποίησή τους. Η παραγόμενη αιμοσφαιρίνη μετράται με υγρή χρωματογραφία υψηλής πίεσης (HPLC) για ανάλυση αλυσίδων και παρατηρούμε ότι μετά από την επίδραση HU και με παραμονή του SCF μετά από το στάδιο της προερυθροβλάστης, αυξάνεται το πηλίκο Gy/Αγ το οποίο ισοδυναμεί με πριμοδότηση της Θγ αλυσίδας( εμβρυϊκό πρότυπο ανάπτυξης). Η ποσότητα όμως της παραγόμενης HbF είναι μειωμένη έως τη 11η ημέρα της καλλιέργειας, σε σχέση με τα κύτταρα μάρτυρες και αυξάνεται τη 14η. Τελικά σε καλλιέργεια ώριμων ερυθροβλαστών μετά από τη δράση της HU και με συνεχή προσθήκη SCF αυξάνεται ο αριθμός των F+ κυττάρων, παράγεται HbF με πριμοδότηση της Θγ αλυσίδας και η παραγωγή αιμοσφαιρίνης HbF αυξάνεται τη 14η ημέρα της καλλιέργειας. Αντιθέτως σε καλλιέργειες όπου διακόπτεται ο SCF μετά το στάδιο της προερυθροβλάστης και προστίθεται HU, το κύτταρο προχωρά τη διαφοροποίησή του πιο γρήγορα. Τη 12η ημέρα έχει αυξήσει την παραγωγή της HbF, ως αποτέλεσμα της δράσης της HU στα ίδια με προηγουμένως επίπεδα, αλλά με πριμοδότηση της Αγ αλυσίδας (πρότυπο ανάπτυξης ενηλίκου) και ακολουθεί ελάττωση της παραγωγής τη 14η ημέρα έως τα επίπεδα παραγωγής των μαρτύρων. Μελετώντας παράλληλα την παραγωγή των γ- μεταγράφων καταγράφεται ότι στα κύτταρα μάρτυρες αυξάνεται η παραγωγή τους μεταξύ 6ης και 8ης ημέρας καλλιέργειας, ενώ τη 12η ημέρα ελαττώνεται η παραγωγή τους καθώς έχει προχωρήσει η ωρίμανσή τους και έχει αυξηθεί η σύνθεση των β-μεταγράφων. Τα κύτταρα που λαμβάνουν ΙΟΟμΜ HU για μία ημέρα με συνεχή χορήγηση ή με παλμό, αυξάνουν τα επίπεδα παραγωγής των γ-μεταγράφων τη 12η ημέρα της καλλιέργειας. Η παραγωγή της HbF, όπως αυτή εκφράζεται από το λόγο (γ/β+γ) μεταγράφων, αυξάνεται μετά την επίδραση ΙΟΟμΜ HU για μία ημέρα με συνεχή χορήγηση ή με παλμό και είναι υψηλότερη την 8η ημέρα. Αντιθέτως η προσθήκη της HU δεν επηρεάζει την HbA (β/β+γ). Μεταβολές των γ- και β-μεταγράφων παρατηρούνται μετά από τη δράση SCF σε ώριμους ερυθροβλάστες και την αύξηση της χορηγούμενης Ερο (από 4 σε 10u/ml). Η παρουσία του SCF αυξάνει τη παραγωγή των γ-μεταγράφων . Η αύξηση αυτή είναι μικρή την 6Π ημέρα για τα κύτταρα που λαμβάνουν HU, αυξάνει σημαντικά την 12η ημέρα τόσο στα κύτταρα μαρτύρων με δράση και των δύο συγκεντρώσεων Ερο (4 και 10u/ml), όσο και μετά από τη δράση HU. Είναι ξεκάθαρο ότι ο SCF και η Ερο δρουν επικουρικά με την HU για την παραγωγή των γ-μεταγράφων . Εκτός όμως από τη δράση σε μεταγραφικό επίπεδο φάνηκε και δράση της HU στην ωρίμανση των γ-μεταγράφων καθώς αυξάνονται τα γ-μετάγραφα μετά την παράλληλα δράση της HU με έναν αναστολέα της μεταγραφής , την ακτινομυκίνη-D. Επίσης δεν παρατηρήθηκε ύπαρξη μεταφραστικού μηχανισμού καθώς με διακοπή της μετάφρασης με τη χρήση κυκλοεξαμίδης δεν διαταράχθηκε η επαγωγική δράση της HU επί των γ-μεταγράφων. Η περαιτέρω αύξηση των επιπέδων των γ-μεταγράφων παρουσία υδροξυουρίας και ταυτόχρονη προσθήκη κυκλοεξαμίδης αλλά και ακτινομυκίνης-D αποδίδεται στη δράση της υδροξυουρίας σε επίπεδο μεταγραφής και μετα-μεταγραφικής ωρίμανσης, με πιθανή τη σταθεροποιητική δράση της HU στα γ-μετάγραφα. Επομένως στην παρούσα εργασία δείξαμε ότι υπάρχει: • δράση της HU σε επίπεδο μεταγραφής • δράση της HU σε μετα-μεταγραφική τροποποίηση. Σταθερότητα του γ-mRNA. • Η HU δεν χρησιμοποιεί μεταφραστικούς μηχανισμούς μέσω των οποίων να οδηγεί σε αυξημένη σύνθεση HbF. • Δράση της HU για αύξηση του ποσοστού των κυττάρων που εκφράζουν HbF. Επικουρικά με την HU σε αυτή την κατεύθυνση δρα η παρουσία του SCF. • Η προσθήκη αυξημένης συγκέντρωσης Ερο δεν συνεργεί προκειμένου να αυξηθεί το ποσοστό των F+ κυττάρων. • Η παρουσία του SCF σε ώριμους ερυθροβλάστες πριμοδοτεί την σύνθεση Θγ αλυσίδας (πρότυπο ενηλίκου) και οδηγεί σε αυξημένα επίπεδα σύνθεσης HbF την 15η ημέρα της καλλιέργειας. • Η διακοπή της χορήγησης SCF πριμοδοτεί την σύνθεση της Αγ αλυσίδας (πρότυπο εμβρύου) και αυξάνει τα επίπεδα σύνθεσης της Hb F την 12η ημέρα της καλλιέργειας. • Σε ώριμους ερυθροβλάστες που λαμβάνουν HU , stress ερυθροποίηση, το μονοπάτι μετάδοσης σήματός που ενεργοποιείται με τη σύνδεση του SCF με τον υποδοχέα του συνεχίζει να λειτουργεί και επικουρεί στη σύνθεση HbF. Σε ώριμους ερυθροβλάστες των κυττάρων που λαμβάνουν HU χωρίς τη προσθήκη SCF μετά το στάδιο της προερυθροβλάστης, η έκφραση του CD117 μειώνεται με την ωρίμανση των κυττάρων και λόγο της έλλειψης του παράγοντα και τελικά η σύνθεση της HbF είναι μειωμένη. • Η αύξηση της συγκέντρωσης Ερο από 4 σε 10 u/ml οδηγεί σε αύξηση του CD117 στα κύτταρα μάρτυρες που όμως παρουσία του SCF δεν οδηγεί σε αύξηση της παραγόμενης HbF . Επομένως η Ερο δεν χρησιμοποιεί το μονοπάτι του SCF/CD117 και προωθεί μόνο την ωρίμανση των κυττάρων. Τα αποτελέσματα της μελέτης αυτής μας έδωσε σημαντικές πληροφορίες για τους μηχανισμούς που εμπλέκονται στη δράση της υδροξυουρίας στα γονίδια των σφαιρινών παρουσία ή απουσία και άλλων κυτταροκινών και την πιθανή συνδυαστική χρήση τους σε ασθενείς με θαλασσαιμικά σύνδρομα. Η κατανόηση των μηχανισμών δράσης της υδροξυουρίας μπορεί να οδηγήσει στην αναζήτηση άλλων παρόμοιων επαγωγικών ουσιών με στόχο τη χρήση τους σε ασθενείς που δεν ανταποκρίνονται στις ήδη εφαρμοζόμενες θεραπείες.